魁蚶蛋白胰蛋白酶酶解產物的抑菌活性

陳悅　李琦　佟長青　曲敏　李偉

摘要：采用胰蛋白酶對魁蚶蛋白進行不同時間的酶解，比較酶解產物的抑菌活性。選取抑菌活性較好的胰蛋白酶酶解產物進行細菌呼吸抑制研究。通過RP-HPLC對該酶解產物進行分離純化，采用質譜分析其氨基酸序列。結果表明，胰蛋白酶酶解0.5 h所得到的酶解產物對金黃色葡萄球菌及希瓦氏菌具有較好的抑菌活性。其抑制金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌的HMP途徑。RP-HPLC分離純化得到了4個抑菌活性較好的組分。對其中第2組分進行質譜分析得到3個目標多肽，其m/z分別為679、792及905，將這3個目標多肽導入De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） 進行分析，獲得了候選抑菌肽氨基酸序列。

關鍵詞：魁蚶；酶解產物；抑菌活性；呼吸抑制

抗生素長期使用不僅會使細菌產生抗藥性，而且會在動物體內殘留，破壞動物腸道內微生物的平衡。尋找一種安全、無殘留、無副作用的抗生素替代品成為目前亟待解決的問題。研究表明，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可有效抑制細菌、真菌、寄生蟲甚至包膜病毒[1-2]。Bolscher等人認為酶解蛋白法制備抗菌肽可能是生產大量抗菌肽最有前途的方法[3]。

魁蚶（Scapharca broughtonii）屬軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、列齒目（Taxodonta）、蚶科（Arcidae），魁蚶成體個體肥大，肉嫩味美，營養豐富，經濟價值很高，是北方沿海地區重要的經濟貝類之一[4]。張金鈴等研究得到殼聚糖固定化胰蛋白酶對魁蚶肽的制備的最佳工藝[5]。李偉等研究表明魁蚶中含有一種新的具有廣譜的抗菌活性的防衛素[6]。目前，已有大量文獻報道過貝類抗菌肽，但是對魁蚶抗菌肽研究報道還很少，且未見對魁蚶抗菌肽分子量與氨基酸序列的報道。本研究通過利用胰蛋白酶酶解不同的時間，得到的多種酶解產物，并研究其抑菌活性，以期對魁蚶的開發與利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

魁蚶購于大連市長興水產品批發市場；革蘭氏陰性菌大腸桿菌ATCC35218（E.coli ATCC35218）、產氣桿菌（C.perfringens ATCC13124）及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（S.aureus ATCC25923）及枯草芽孢桿菌（B.subtilis ATCC6633）來自于遼寧出入境檢驗檢疫局、革蘭氏陰性菌希瓦氏菌（Shewanella sp.）由農業部暨遼寧省省級高校海洋水產增養殖學與生物技術重點開放實驗室惠贈；昆明小鼠血紅細胞來自于大連醫科大學實驗動物中心；Sephadex LH-20、胰蛋白酶購于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉及牛肉膏購于北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為市售國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 魁蚶肉酶解產物的制備 將去殼后的魁蚶肉，加入等體積的0.9% NaCl后用組織粉碎機勻漿，勻漿后加入2倍體積的0.9% NaCl于4 ℃抽提24 h。抽提液于4 ℃，9 000 r/min條件下離心20 min，棄去沉淀取上清得到可溶性魁蚶蛋白。將得到的可溶性魁蚶蛋白用胰蛋白酶（酶解條件為溫度37 ℃，pH=7.4，加酶量為0.5%）酶解0.5、1、1.5、2及2.5 h，酶解后沸水浴5 min使酶失活，然后于4 ℃，9 000 r/min條件下離心20 min，取上清，冷凍干燥，得到魁蚶肉酶解產物。魁蚶肉酶解產物于4 ℃保存備用。

1.2.2 抑菌活性測試 利用濾紙片法按照文獻[7]中的方法測定魁蚶肉酶解產物抑菌活性。

1.2.3 呼吸抑制測試 分別取30 mL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液、2 mL 1%葡萄糖溶液及2 mL活化后適宜濃度的希瓦氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，置于測量瓶中不間斷劇烈攪拌5 min。將溶氧測定儀傳感器置于混合液中，密封后開動磁力攪拌器，每間隔1 min記錄一次氧氣濃度，記錄10 min內平均溶氧濃度（單位：mg O2/L），計算出空白氧氣消耗速率。將上述測量瓶中加入200 μL丙二酸溶液（50 mg/mL，Sodium phosphate）測定氧氣消耗速率。分別以200 μL磷酸鈉溶液（50 mg/mL）、200 μL碘乙酸溶液（50 mg/mL）、200 μL魁蚶肉酶解產物（10 mg/mL）、200 μL磷酸鈉溶液與200 μL魁蚶肉酶解產物混合液、200 μL碘乙酸溶液與200 μL魁蚶肉酶解產物混合液及200 μL丙二酸溶液與200 μL魁蚶肉酶解產物混合液，代替丙二酸溶液，測定氧氣消耗速率[8]。

按照文獻[9-10]中的方法，計算抑菌劑對細菌呼吸抑制率IR，以及典型抑制劑對魁蚶肉酶解產物的疊加抑制率RR。

1.2.4 魁蚶肉酶解產物的分離純化 選擇抑菌活性最好的酶解產物進一步分離純化。將魁蚶肉酶解產物（胰蛋白酶酶解0.5 h）溶于ddH2O配制成30 mg/mL的溶液，8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用0.22 μm水膜過濾，得到樣液。使用C18柱，通過P230型高效液相色譜儀分離，檢測波長為220 nm，梯度洗脫條件如表1。收集具有抑菌活性的洗脫峰，在通風廚揮發完甲醇后，冷凍干燥，得到魁蚶肉酶解純化物。

1.2.5 肽分子量測定 利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（5800 MALDI-TOF/TOF）對具有抑菌活性的魁蚶肉酶解產物的RP-HPLC純化物進行分子量測定。通過正離子模式下選擇反射方法對樣品測試范圍進行校準測試后對樣品在正離子模式下選擇反射方法測試樣品分子量。標準物質校準范圍為：1 046.542±05、1 533.858±0.5、2 465.199±0.5及3 494651±0.5。

1.2.6 氨基酸序列測定 氨基酸序列測定利用MALDI-TOF/TOF對RP-HPLC分離純化得到的魁蚶肉酶解純化物從頭測序（De novo sequencing），首先對多肽樣品進行一級質譜（MS）測試，之后選擇目標多肽對應母離子進行二級質譜測試（MS/MS），將二級碎片離子數據導入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）進行分析獲得候選肽段氨基酸序列。

2 結果與討論

2.1 魁蚶肉酶解產物抑菌活性的測定

對胰蛋白酶酶解0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 h得到的魁蚶蛋白酶解產物進行抑菌活性測定。從表2中可以看出，酶解0.5 h的酶解產物抑菌活性較好，能抑制產氣桿菌、金黃色葡萄球菌及希瓦氏菌。此外，不同時間的酶解產物均能抑制金黃色葡萄球菌，酶解1.0、1.5及2.0 h對希瓦氏菌也有較弱的抑制活性。

2.2 呼吸抑制測定

通過觀察丙二酸、碘乙酸及磷酸鈉三種典型的糖代謝抑制對細菌的呼吸抑制率以及樣品與這3種抑制劑組合后的呼吸抑制率，可以得出樣品對細菌的呼吸代謝抑制途徑[8，11]。如表3所示，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產物與金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌共存時，均表現出對希瓦氏菌呼吸代謝的抑制效應，且均與磷酸鈉組成的組合抑制劑疊加抑制率最低，抑制金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌糖氧化代謝途徑的HMP途徑。

2.3 RP-HPLC分離純化及抑菌活性的測定

將胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產物通過RP-HPLC直接進行分離純化，并對其中的部分峰進行抑菌活性實驗。實驗結果如圖1所示。

利用基質輔助激光解析飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）對峰2進行從頭測序（De novo sequencing）。首先對峰2樣品進行一級質譜（MS）測試，之后選擇目標多肽對應母離子進行二級質譜測試（MS/MS），共得到3個目標多肽，其m/z分別為679、792、905。然后將這3個目標多肽的二級碎片離子數據導入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）進行分析獲得候選氨基酸序列。結果如表5所示，m/z為679、792、905的多肽，得分70分以上的候選氨基酸序列分別為2、5、5個。

3 結論

胰蛋白酶酶解魁蚶蛋白酶解產物的抑菌活性較好。其中胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產物對產氣桿菌、希瓦氏菌抑菌活性都較好，對金黃色葡萄球菌也表現出抑菌活性。對呼吸抑制的研究表明，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產物對希瓦氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制都是通過抑制其糖氧化代謝的HMP途徑。對魁蚶肉酶解產物凝集活性進行測試結果顯示，胰蛋白酶酶解魁蚶肉的酶解產物的細菌凝集活性與其抑菌活性沒有直接關系。將胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產物通過RP-HPLC分離純化得到4個活性組分，測得峰2分子量792.59。對峰2進行進一步研究，得到3個目標多肽，將這3個目標多肽導入De nov Explorer（TM）Software（ABSCIEX ；Version 4.1）進行De nove測序分析，得到候選氨基酸序列。

參考文獻：

[1]Afshar M， Gallo RL.Innate immune defense system of the skin [J].Veterinary dermatology，2013，24（1）：32-49

[2] Hoang VLT，Kim SK.Antimicrobial peptides from marine sources [J].Current Protein and Peptide Science，2013，14（3）：205-211

[3] Bolscher JGM，van der Kraan MIA，Nazmi K，et al.A one-enzyme strategy to release an antimicrobial peptide from the LFampin-domain of bovine lactoferrin [J].Peptides，2006（27）：1-9

[4] 王穎，吳志宏，李紅艷，等.不同地理群體魁蚶的營養成分比較研究[J].食品科學，2013，34（3）：248-252

[5] 張金鈴，遲海，李偉，等.殼聚糖固定化胰蛋白酶制備魁蚶肽的研究[J].水產科學，2010，29（9）：553-555

[6] 李偉，金橋，姬文婷，等.魁蚶防衛素分離純化及其抑菌作用的研究[J].食品工業科技，2010（9）125-129

[7] 李偉，陳文，佟長青，等.菲律賓蛤仔凝集素的分離純化及抑菌活性研究[J].大連海洋大學學報，2012，27（4）：333-337

[8] 佟長青.兩種海洋雙殼貝類凝集素及其抑菌機制的研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2013

[9] 陳亞非，黃凱玲，高健華，等.α-溴代肉桂醛及烷烯基酸酯類對微生物的呼吸代謝的抑制作用研究[J].食品與發酵工業，1994（3）：26-29

[10] 陳亞非，黃凱玲，高健華，等.α-溴代肉桂醛及烷烯基酸酯類對鮮草菇呼吸代謝的抑制[J].食品科學，1994，（9）：9-12

[11] 汪海洪，包杰中，寧正祥，等.富馬酸二甲酯對微生物生長和呼吸的抑制作用[J].食品與發酵工業，1993，12（2）：1-6

Abstract：Scapharca Broughtonii proteins were digested using trypsin for different time， and the antibacterial activities of the obtained hydrolysates were investigated.Inhibition of respiration was carried out using the hydrolysates with stronger antibacterial activities.The hydrolysates were isolated and purified on RP-HPLC column， and the amino acid sequences were analyzed by mass spectrometry.The results showed that the hydrolysates digested by typsin for 0.5 h could better inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Shewanella sp.They inhibited Hexose Monophophate Pathway （HMP） of S.aureus and Shewanella sp.Four fractions with better antibacterial activities were isolated and purified on RP-HPLC column.Three peptides found in the 2nd fraction were analyzed by MS/MS， and their m/z were 679， 792 and 905， respectively.The three peptides were analyzed using De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） and the candidate amino acid sequences were obtained.

Key words：Scapharca Broughtonii； Enzymatic hydrolysate； Antibacterial acitivity； Inhibition of respiration