高效液相色譜法檢測鯽魚不同組織中的膠原蛋白含量

貢雯玉，卞 歡，吳海虹，王道營，耿志明，劉　芳，張牧焓，徐為民，諸永志，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095）

高效液相色譜法檢測鯽魚不同組織中的膠原蛋白含量

貢雯玉1，2，卞 歡1，吳海虹1，王道營1，耿志明1，劉芳1，張牧焓1，徐為民1，諸永志1，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095）

為提高水產(chǎn)品膠原蛋白的利用率，采用柱前衍生-高效液相色譜法對鯽魚魚皮、魚肉、魚鱗、魚鰾組織中的羥脯氨酸含量進行檢測，再將羥脯氨酸含量換算成相應膠原蛋白的含量。鯽魚樣品經(jīng)鹽酸110 ℃水解18 h，丹磺酰氯衍生，采用高效液相色譜-紫外法進行檢測。色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為甲醇，B為四氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（1∶15∶84，V/V）溶液，采用梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長 254 nm。結果表明：羥脯氨酸在20～400 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的關系（R2=0.999 8），最低檢測限為0.18 μg/g，不同水平的平均回收率為80.22%～83.33%，相對標準偏差范圍為0.31%～1.84%。實際樣品分析顯示，魚皮、魚肉、魚鱗、魚鰾組織中膠原蛋白含量分別為106.62、24.75、166.94、115.05 mg/g。本實驗建立的分析方法簡便快捷、具有較好的靈敏度和可靠性，可用于水產(chǎn)品不同組織中膠原蛋白的定量分析。

鯽魚；羥脯氨酸；膠原蛋白；高效液相色譜法

隨著生活節(jié)奏的加快，用傳統(tǒng)方法熬制湯煲過于耗時，因此健康快捷的湯煲類產(chǎn)品將會有很大的市場空間。目前，湯煲類產(chǎn)品主要為沖調(diào)型湯煲和真空包裝型湯煲［1］；沖調(diào)型湯煲營養(yǎng)欠缺，真空包裝型湯煲食材易爛且有蒸煮味，因此當務之急是開發(fā)新型湯煲類產(chǎn)品。鯽魚（Carassius auratus）是我國國民消費的大眾品種，在淡水魚中營養(yǎng)最為豐富；其肉質(zhì)細嫩，比畜、禽肉更容易消化和吸收，產(chǎn)婦食用鯽魚湯能有效催乳，對母體恢復也有很好的補益作用，鯽魚濃湯也是家庭中最為普遍的食用方法。鯽魚含有全面且優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，其 中膠原蛋白占鯽魚總蛋白質(zhì)含量的25%～30%［2］，相當于體質(zhì)量的6%，是含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白主要存在于鯽魚的皮、骨、軟骨、鱗中，是結締組織重要的結構蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護機體的作用［3］。膠原蛋白的濃度越大，其分子間的交聯(lián)度就越大，形成的凝膠結構就越致密，凝膠強度也越大，所以本實驗研究鯽魚不同組織膠原蛋白含量，以膠原蛋白含量多的組織作為原料處理后（如魚鱗膠）加入鯽魚湯，制作天然營養(yǎng)的固體凝膠型鯽魚湯，以此填補產(chǎn)品空白。目前，國內(nèi)外關于水產(chǎn)中膠原的報道集中在深海魚（黃鰭金槍魚、小須鯨、河豚、尖吻鱸、鱈魚等）［4-6］、淡水魚皮、魚鱗（鯉魚、羅非魚、草魚等）［7-10］的膠原提取工藝，以及水產(chǎn)品如海參的羥脯氨酸含量研究上，而對淡水魚中各部分組織膠原的定量分析報道很少。

膠原蛋白中含有2 種特有的氨基酸——脯氨酸和羥脯氨酸，它們的含量很高，約占25%［11-12］。羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性氨基酸，在膠原蛋白的生物合成過程中，沒有游離的羥脯氨酸參與合成，所有的羥脯氨酸均由已合成的肽鏈中的脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉(zhuǎn)化而來。膠原蛋白中的羥脯氨酸含量穩(wěn)定，通過測定羥脯氨酸的含量即可獲得膠原蛋白含量［13-14］。傳統(tǒng)測定羥脯氨酸的方法是比色法［15-16］，樣品需要量大，操作步驟繁瑣，影響因素多，且特異性、靈敏性差；氨基酸自動分析法是一種快速、準確靈敏度高的測定方法［17-21］，適用于多種氨基酸同時分析，對于單一氨基酸的分析而言其費用高，普通實驗室難以實現(xiàn)；高效液相色譜儀具有優(yōu)良的靈敏度和精密度，近年來廣泛用于氨基酸、尤其是單一氨基酸的分析測定。本實驗以丹磺酰氯（dansyl chloride，Dns-Cl）作為液相色譜柱前衍生試劑，通過樣品水解、衍生條件的確立、以及高效液相色譜分離、檢測條件的優(yōu)化，建立鯽魚魚皮、魚肉、魚鱗、魚鰾組織中羥脯氨酸的定量檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鯽魚 市購；新鮮鯽魚經(jīng)宰殺之后，去內(nèi)臟，清洗魚腹內(nèi)的黑膜。分別取不同部位樣品組織，切碎待用。

L-羥基脯氨酸標準品（L-Hyp，純度99%） 美國Aladdin公司；甲醇、四氫呋喃（均為色譜純） 美國Tedia公司；衍生試劑：Dns-Cl（純度＞98%） 日本TCI公司；稱取0.04 g Dns-Cl，用丙酮溶解，并定容至10 mL，4 ℃避光保存，有效期3 d；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

e2695高效液相色譜（配有二極管陣列檢測器、XBridge C18色譜柱） 美國Milford公司；HS2060A超聲波振蕩器 常州國華電器有限公司；烘箱 上海索譜儀器有限公司；純水儀 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液配制

稱取適量羥脯氨酸標準品，用超純水溶解，配制1.00 g/L標準貯備液，于4 ℃保存，臨用時用超純水稀釋配制質(zhì)量濃度為20～400 μg/mL系列標準工作溶液。

1.3.2樣品處理

稱取2 g（準確至0.001 g）絞碎后的樣品于10 mL水解管中，加入6 mol/L鹽酸溶液6 mL，充氮氣1 min，抽真空至管內(nèi)鹽酸起泡，用火焰封口，于110 ℃烘箱中水解18 h。冷卻后，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加水至刻度。混勻后，取5 mL水解液于10 mL容量瓶中，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，加水稀釋至刻度。稀釋液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待高效液相色譜分析。

1.3.3衍生

取過濾后的稀釋液1 mL于10 mL具塞離心管中，加飽和碳酸氫鈉溶液400 μL，衍生試劑800 μL，旋渦混勻30 s，80 ℃水浴中避光反應45 min，取出迅速冷卻，加入1 mol/L鹽酸溶液800 μL終止反應，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待高效液相色譜分析。

1.3.4色譜條件

梯度洗脫程序見表1，色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為甲醇，B為四氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（1∶15∶84，V/V）溶液；梯度洗脫，流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm；進樣量20 μL。

表1　梯度洗脫程序Table1　Gradient elution program

1.3.5精密度實驗

配制不同質(zhì)量濃度的羥脯氨酸標準溶液，按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法處理，并進行高效液相色譜測定，以測定的結果計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6回收率實驗

分別稱取2 g不同組織樣品，根據(jù)其羥脯氨酸含量添加不同水平（50%、100%、150%）的羥脯氨酸標準品，按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法進行實驗，測定羥脯氨酸含量，計算回收率，每一樣品做3 次平行實驗。

1.3.7計算公式

回收率和膠原蛋白含量按公式（1）、（2）計算：

式中：X為加入羥脯氨酸后樣品中羥脯氨酸的測定總量/mg；Y為樣品中羥脯氨酸測定量/mg；Z為加入標準羥脯氨酸量/mg。

2　結果與分析

2.1水解條件的確定

測定蛋白質(zhì)中的氨基酸首先要通過水解破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，一定濃度的酸液可以使膠原蛋白水解為肽及游離的L-氨基酸，并釋放到溶劑中。酸水解的優(yōu)點是水解徹底，水解的最終產(chǎn)物是L-氨基酸，沒有旋光異構體產(chǎn)生。酸濃度和溫度對動物組織膠原蛋白的水解過程有較大影響，增加酸濃度和提高溫度可使反應進程加快，使膠原蛋白水解為多肽的過程更徹底［22］。本實驗觀察了水解溫度、時間以及鹽酸濃度對鯽魚不同組織中膠原蛋白水解產(chǎn)生羥脯氨酸的影響，最終確定的水解條件為：水解溫度110 ℃，6 mol/L鹽酸溶液中水解18 h。

2.2衍生試劑選擇

動物組織中的膠原蛋白經(jīng)酸水解后生成包括羥脯氨酸在內(nèi)的氨基酸混合物，羥脯氨酸本身不具有紫外、熒光吸收，需要衍生后才能進行分析。Dns-Cl在氨基酸的液相色譜分析中有著廣泛的應用［23］，常作為液相色譜的柱前衍生試劑［24］。Dns-Cl可以同伯胺或仲胺基上的活潑氫反應，脫掉一分子的HCl生成具有熒光和紫外吸收的衍生物，其衍生操作簡單、衍生物穩(wěn)定性較好、可定量完成磺酰化反應、有較強的熒光和紫外吸收。本實驗同樣選擇Dns-Cl作為鯽魚不同組織膠原蛋白水解液中羥脯氨酸的柱前衍生試劑，衍生產(chǎn)物在C18柱上的分離效果好，干擾峰極少，譜圖干凈，如圖1所示。

圖1　40000 μg/mL羥脯氨酸標準樣品的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of Hyp standard solution at 400 μg/mL

2.3色譜條件優(yōu)化

實驗中流動相A為甲醇，B為四氫呋喃、甲醇和0.05 mol/L乙酸鈉組成的混合溶液。其中對乙酸鈉緩沖液分別配制了3 種不同pH值分別為4.8、4.0、3.4，觀察了三者對羥脯氨酸在C18柱上保留行為的影響。結果發(fā)現(xiàn)，pH值越低越有利于分離，有些文獻報道使用pH值為3.1的緩沖液，但考慮到色譜柱的使用壽命，選擇pH值為3.4的乙酸鈉緩沖液，在pH值為3.4時羥脯氨酸的峰形最好，并且保留時間明顯提前；四氫呋喃的加入能有效地改善峰形和分離度。甲醇、四氫呋喃和乙酸鈉溶液體積比為1∶15∶84時，經(jīng)過梯度洗脫可以有效的調(diào)節(jié)保留時間且擁有良好的檢測限。

實驗中為選擇最佳洗脫梯度，分別設置了不同的洗脫程序進行測定。結果發(fā)現(xiàn)流動相A的比例越小物質(zhì)分離越完全，并且可以將雜質(zhì)很好的分離，在不斷增加甲醇比例時0.6 mL/min的增加速率為最佳，最終選擇梯度洗脫程序如表1所示。

為選擇最佳檢測波長，本實驗采用三波長模式（240、254 nm和260 nm）同時檢測羥脯氨酸含量，如圖2所示。結果表明，羥脯氨酸在波長254 nm處有最大吸收峰，且在波長254 nm處基線穩(wěn)定，因此將檢測波長設為254 nm。

本實驗還考察溫度、流速對羥脯氨酸在C18柱上的保留行為的影響，二者對羥脯氨酸的保留時間有一定影響，但對檢測靈敏度影響不大，最終將溫度設為40 ℃，流速1.0 mL/min。在設定的色譜條件下，羥脯氨酸保留時間約27.1 min，如圖2所示。

圖2　樣品在不同波長條件下的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of sample at different wavelengths

2.4線性范圍及最低檢測限

按照3 倍信噪比計算最低檢測限，得出方法的最低檢測限為0.18 μg/g。

取標準貯備液，分別用水配制質(zhì)量濃度為20、50、100、200、400 μg/mL的羥脯氨酸系列標準工作溶液。取1 mL上述系列標準溶液于10 mL具塞離心管中，分別按1.3.3節(jié)方法衍生，其中衍生后羥脯氨酸的質(zhì)量濃度依次為6.67、16.67、33.34、66.67、133.33 μg/mL。在波長254 nm處進行高效液相色譜測定分析，以羥脯氨酸衍生后質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標X，以對應峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。回歸方程Y=1.35×105X－8.56×103，相關系數(shù)R2為0.999 8。由此可見在質(zhì)量濃度20～400 μg/mL范圍內(nèi)，羥脯氨酸質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關系。

2.5精密度

配制100、200、300 μg/mL羥脯氨酸標準溶液，取1 mL上述標準溶液于10 mL具塞離心管中，分別按1.3.3節(jié)方法衍生，其中衍生后質(zhì)量濃度分別為33.34、66.67、100 μg/mL，按照1.3.4節(jié) 色譜條件進行分析，每個質(zhì)量濃度重復操作3 次，記錄峰面積，得100、200、300 μg/mL的羥脯氨酸標準溶液峰面積的RSD分別為1.34%、0.31%、1.84%，結果表明本實驗建立的方法具有良好的精密度。

2.6回收率

分別取鯽魚不同部位魚皮、魚肉、魚鰾、魚鱗的組織樣品測定羥脯氨酸，計算回收率，結果見表2。

表2　鯽魚不同組織樣品羥脯氨酸添加水平回收率測定結果（ n=3）Table2　Recoveries of Hyp spiked at different levels （n = 3）

由表2可以看出，樣品回收率在72.67%～91.00%之間，魚皮、魚肉、魚鰾、魚鱗樣品中平均回收率分別為80.22%、83.33%、80.72%、80.67%，可滿足鯽魚不同組織中膠原蛋白分析研究的需要。

2.7實際樣品分析

表3　實際樣品分析結果（n=3）Table3　Contents of Hyp in real samples （n=3）

分別分析了鯽魚不同部位魚皮、魚肉、魚鰾、魚鱗的組織樣品中羥脯氨酸的含量，結果見表3。鯽魚4 個部分中魚鱗膠原蛋白含量最多為166.94 mg/g，魚肉膠原蛋白含量最少為24.75 mg/g，各組織樣品的RSD在0.52%～3.00%之間。曾名勇等［25］用氨基酸自動分析儀測得鯽魚魚皮中羥脯氨酸含量為8.12 mg/g，鱸魚魚皮膠原含量為8.75 mg/g，鳙魚魚皮膠原含量為8.34 mg/g；詹永獻［26］用分光光度法測得的草魚魚鰾中羥脯氨酸含量為49.7 mg/g；潘楊［27］根據(jù)Woessner J法計算鰱魚魚鱗中羥脯氨酸的含量為41.6 mg/g。含量有所差異可能和測量方法、組織來源、部位不同有關，但羥脯氨酸在膠原蛋白中含量穩(wěn)定，約占9%，膠原蛋白含量高，其羥脯氨酸含量也高，將測得的羥脯氨酸含量乘以相關系數(shù)11.1即為膠原蛋白的含量。

3　結 論

本實驗通過樣品水解條件確定、衍生試劑選擇和色譜條件的優(yōu)化，建立了鯽魚魚皮、魚肉、魚鱗、魚鰾組織中羥脯氨酸的高效液相色譜檢測方法，從而計算出相應的膠原蛋白含量。鯽魚組織經(jīng)鹽酸110 ℃水解18 h，Dns-Cl衍生，然后以甲醇和四氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（1∶15∶84，V/V）溶液為流動相、在反相C18柱上進行分離。在20～400 μg/mL范圍內(nèi)關系良好（R2為0.999 8），最低檢測限為0.18 μg/g，平均回收率為80.22%～83.33%，RSD范圍為0.31%～1.84%，同時檢測出鯽魚魚皮、魚肉、魚鱗、魚鰾組織中膠原蛋白含量分別為106.62、24.75、166.94、115.05 mg/g。

本實驗建立的鯽魚不同組織中羥脯氨酸的高效液相色譜檢測方法，操作簡便、具有良好的靈敏度和準確性。鑒于鯽魚湯是家庭中最為普遍的食用方法、以及家庭鯽魚湯制作耗時較長，后續(xù)研究將圍繞以膠原蛋白含量多的組織為原料，進行處理后（如魚鱗膠）加入鯽魚湯中，制作天然營養(yǎng)的固體凝膠型魚湯。

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Determination of Collagen in Different Tissues of Crucian Carp （Carassius auratus） by High Performance Liquid Chromatography

GONG Wenyu1，2， BIAN Huan1， WU Haihong1， WANG Daoying1， GENG Zhiming1， LIU Fang1， ZHANG Muhan1， XU Weimin1， ZHU Yongzhi1，*
（1. Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；2. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

In order to improve the utilization of collagen in fishery products， a high performance liquid chromatographic（HPLC） method with pre-column derivatization was established to determine hydroxyproline in the skin， meat， scale， and blubber of the crucian carp Carassius auratus and the content of collagen was calculated based on hydroxyproline levels in samples. Samples were hydrolyzed by hydrochloric acid at 110 ℃ for 18 h， followed by pre-column derivatizations with dansyl chloride. Hydroxyproline was determined by HPLC connected to an ultraviolet detector （HPLC-UV）. The chromatographic co nditions were set as follows： column， C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）； mobile phase， A： methanol， B：tetrahydrofuran-methanol-0.05 mol/L sodium acetate （1：15：84， V/V）； flow rate， 1.0 mL/min； co lumn temperature， 40 ℃； and detect ion wavelength， 254 nm. Results showed a good linear relationship existed when hydroxyproline was in the range of 20-400 μg/mL （R2= 0.999 8）. The limit of detection （LOD） was 0.18 μg/g and the average recoveries were 80.22%-83.33% with relative standard deviations （RSDs） of 0.31%-1.84%. The contents of collagen in skin， meat， scale， blubber of crucian carp were 106.62， 24.75， 166.94， 115.05 mg/g， respectively. The present method proved to be of high maneuverability，excellent sensitivity and accuracy， and could be employed to analyze collagen contents in fishery products.

crucian carp （Carassius auratus）； hydroxyproline； collagen； high performance liquid chromatography （HPLC）

TS254.7

A

1002-6630（2015）14-0065-05

10.7506/spkx1002-6630-201514013

2014-11-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B00）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（14）2117）

貢雯玉（1991—），女，碩士研究生，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。E-mail：gwy3428@163.com

諸永志（1975—），男，副研究員，碩士，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。E-mail：yongzhizhu@163.com