糖尿病足殼聚糖凝膠劑的研制

朱業(yè)靖

菏澤市立醫(yī)院藥學(xué)部，山東菏澤　274031

糖尿病足殼聚糖凝膠劑的研制

朱業(yè)靖

菏澤市立醫(yī)院藥學(xué)部，山東菏澤274031

目的 研究糖尿病足殼聚糖凝膠劑的制備工藝，建立質(zhì)量控制方法。方法 以殼聚糖、重組人表皮因子為材料制備糖尿病足殼聚糖凝膠劑，并以大鼠皮膚燙傷模型評(píng)價(jià)凝膠劑在創(chuàng)面的修復(fù)效果。結(jié)果 該凝膠劑制備工藝簡(jiǎn)單，質(zhì)量穩(wěn)定，對(duì)大鼠皮膚燙傷具有明顯的療效。結(jié)論 該凝膠劑符合《中華人民共和國(guó)藥典》凝膠劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，治療糖尿病足具有良好的應(yīng)用前景。

糖尿病足；殼聚糖；凝膠劑；制備方法；潰瘍愈合

殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)物，具有無(wú)毒、生物相容性、生物可降解性、抗菌活性以及治愈傷口等特點(diǎn)［1］，是一種理想的生物醫(yī)藥材料。將殼聚糖與表皮生長(zhǎng)因子合用，可加快皮膚創(chuàng)面的上皮化愈合［2］。

1　材料與方法

1.1儀器和試藥

1.1.1儀器 WMK-02型電熱恒溫箱；-20低溫冰箱；LD-2A離心機(jī)；79HY-1型磁力攪拌器；PHS-3C型pH計(jì)。

1.1.2試藥 殼聚糖；胰島素注射液（；重組人表皮生長(zhǎng)因子；月桂氮卓酮；其他輔料均為藥用規(guī)格；試劑均為分析純。

1.1.3動(dòng)物清潔雌性SD大白鼠

1.2處方與制備

1.2.1處方 胰島素注射液5 ml，重組表皮生長(zhǎng)因子45 ml，殼聚糖10 g，月桂氮卓酮5 g，甘油50 g，鹽酸適量，三乙醇胺10 g，純化水加至1000 g。

1.2.2制備 稱取10 g殼聚糖溶于500 ml 0.1 mol/L的稀鹽酸得到2%的殼聚糖溶液，置于4℃冰箱備用；取5 ml胰島素注射液和45 ml重組表皮生長(zhǎng)因子混合均勻，在冰浴及磁力攪拌下，將混合溶液緩慢加入殼聚糖溶液中；依次加入50 g甘油和5 g月桂氮卓酮，攪拌均勻；再加入三乙醇胺10 g充分?jǐn)噭颍{(diào)節(jié)pH值為6.0-7.0，加純化水至1000 g，攪拌15 min，即得透明狀半固體狀凝膠，分裝于包裝管內(nèi)，20 g/支。

1.3質(zhì)量控制

1.3.1性狀 本品為均勻細(xì)膩、黏稠適宜的透明狀半固體凝膠劑。

1.3.2pH測(cè)定 凝膠1 g加水20 ml，溶解均勻后用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.3均勻性凝膠5 g置于5 ml離心管中，以2500 rpm離心30 min，觀察是否分層。

1.3.4鋪展性和可洗除性將凝膠均勻涂在手背上，觀察能否涂抹均勻，并在水龍頭下沖洗30 s，觀察能否洗除［3］。

1.3.5無(wú)菌試驗(yàn) 按《中國(guó)生物制品規(guī)程（一）》（2010版）的“生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程”進(jìn)行。

1.3.6含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線按人表皮生長(zhǎng)因子放射免疫分析藥盒說明書制作，當(dāng)凝膠中rhEGF的濃度為0.1、1 和10 μg/g時(shí)，回收率分別為（90.31±6.09）%、（95.05±6.08）%和（101.62±9.62）%。含量測(cè)定時(shí)，精密稱取rhEGF凝膠約50 mg，加5 mL緩沖液使溶解均勻后，繼續(xù)用緩沖液分兩次稀釋100倍，取0.1 mL樣品液，采用RIA發(fā)測(cè)定樣品液中rhEGF的濃度，并計(jì)算凝膠劑中rhEGF濃度及含量。

1.3.7體外釋放參照DiBiase等［4］的方法進(jìn)行。釋放池孔徑25 mm，深5 mm。體外釋放條件：釋放介質(zhì)200 mL，槳葉轉(zhuǎn)速50 rpm，水浴溫度32℃。

1.3.8穩(wěn)定性 凝膠劑適量置于密閉離心管中，分別于60℃、37℃、室溫和冰箱冷藏室（4℃±3℃）保存，定時(shí)檢查凝膠劑的外觀、失水、酸堿度及霉敗等現(xiàn)象，并取樣測(cè)定凝膠劑中rhEGF含量。

1.4動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

清潔雌性SD大白鼠，體質(zhì)量0.20～0.25 kg，實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天禁食，用10%水合氯醛（0.3 mL/ 100g體質(zhì)量）腹腔內(nèi)注射麻醉，以8%硫化鈉在大鼠背部?jī)裘儆脺責(zé)崴疀_洗涂擦部位，將大鼠置于帶有圓形孔的厚板上，使脫毛部位正對(duì)該孔，在厚板下置恒溫水浴鍋，用96℃的恒溫水浴蒸氣灼燙大鼠背部6 s，造成局部皮膚深I(lǐng)I度燙傷，燙傷后大鼠腹腔注射林格氏液5 mL抗休克［5］。

1.5用藥方法

各組均在燙傷后第2天開始用藥，A組給予糖尿病足殼聚糖凝膠劑0.05 mL，B組給予復(fù)方溶液（1.0 mL胰島素+9.0 mL rhEGF+110 mL生理鹽水）0.05 mL，C組給予殼聚糖空白凝膠0.05 mL。將藥物均勻涂于相應(yīng)潰瘍面，待干燥10 min后用無(wú)菌凡士林醫(yī)用紗布包扎，單籠喂養(yǎng)，每天換藥1次。

1.6大鼠潰瘍面積觀察

于燙傷后第1、3、7、11、15天給潰瘍面照相，用透明膜覆蓋潰瘍面沿創(chuàng)緣描記、剪膜，置分析天平稱取質(zhì)量換算面積，觀察潰瘍愈合情況。創(chuàng)面愈合百分率（%）=（原創(chuàng)面總面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原創(chuàng)面總面積× 100%。

1.7組織學(xué)觀察

于燙傷后1、3、7、15天每組取2只大鼠采用頸椎脫臼法處死后，取全厚皮膚潰瘍組織，固定于10%的福爾馬林溶液中，然后脫水、石蠟包埋切片，進(jìn)行及新生血管、膠原改變等，以評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合效果。

1.8統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1凝膠劑質(zhì)量檢查

該凝膠劑為無(wú)色半透明、質(zhì)地均勻的凝膠制劑，無(wú)細(xì)菌污染，鋪展性和可洗除性良好，凝膠劑的粘度適合于臨床使用。pH值為（6.43±0.05）（n=3），含量為標(biāo)示量的（102.6±2.0）%（n=3）。體外釋放符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模式。不同溫度下的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該凝膠劑置于密閉離心管中60℃保存8天、37℃保存3個(gè)月 以及室溫和冰箱保存6個(gè)月時(shí)，凝膠劑幾乎沒有失水（重量減少＜5%），沒有霉敗，外觀、pH均無(wú)變化。室溫和冰箱保存3個(gè)月，凝膠劑的殘留活性分別為（71.86±6.78）%和（101.56± 6.47）%。

2.2大鼠潰瘍創(chuàng)面面積

傷后各時(shí)間點(diǎn)A組創(chuàng)面愈合率均顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），傷后3天B、C兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），傷后7、1l、15天B組創(chuàng)面愈合率均明顯高于C組（P＜0.05），見表1。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面愈合百分率比較［n=6，（%）］

2.3組織學(xué)觀察

傷后3天，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表皮萎縮變薄，部分毛囊及皮脂腺崩解，其中A組真皮內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，余未見明顯炎性細(xì)胞；傷后7 d，皮膚表面見大量滲出液及大量炎性細(xì)胞混合形成的痂，表皮內(nèi)見水泡，真皮內(nèi)見水腫，B、C組表皮幾乎完全脫落，糜爛明顯，C組表皮下水腫明顯于A組，表皮內(nèi)水泡也明顯于A組；傷后15 d，表皮內(nèi)水泡及真皮內(nèi)水腫消失，A組皮膚表面滲出減少至消失，真皮炎性細(xì)胞明顯減少，肉芽組織明顯增生，成纖維細(xì)胞增多，紅色膠原纖維增多，排列有序，B組肉芽組織增生，少許成纖維細(xì)胞增生，紅色膠原纖維增多，C組修復(fù)最不好，脫落表皮未修復(fù)，真皮內(nèi)仍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少許肉芽組織增生。

3　討論

表皮生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)角化細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向受損部位遷移，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。與胰島素合用，兩者可以協(xié)同促進(jìn)燙傷潰瘍創(chuàng)面的愈合，將兩者裝載于以殼聚糖為基質(zhì)的新型凝膠體系中，制備成糖尿病足殼聚糖凝膠劑，可使藥物與創(chuàng)面接觸時(shí)緩慢而均勻的釋放，從而延長(zhǎng)其作用于潰瘍創(chuàng)面的時(shí)間，促進(jìn)傷口的愈合。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該胰島素聯(lián)合rhEGF的新型復(fù)方殼聚糖凝膠劑可以較好地促進(jìn)燙傷潰瘍創(chuàng)面的愈合，且作用效果明顯優(yōu)于復(fù)方溶液組和殼聚糖空白凝膠基質(zhì)組，治療15 d后的平均愈合百分率可達(dá)到93%，說明該殼聚糖凝膠體系對(duì)皮膚潰瘍創(chuàng)面具有良好的治療效果。組織病理學(xué)的結(jié)果顯示，治療后期，復(fù)方凝膠劑組的皮膚表面肉芽組織明顯增生，成纖維細(xì)胞明顯增多，紅色膠原纖維增多，排列整齊有序。

［1］陳榕，韋偉，王立軍，等.殼聚糖與生長(zhǎng)因子復(fù)合貼劑促創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（10）：1266

［2］種靜芬，歐陽(yáng)輝.表面活性劑在藥學(xué)中的應(yīng)用［M］.1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：258-288.

［3］卓陽(yáng)，周雪雪，羅行華，等.新型復(fù)方凝膠劑對(duì)燙傷大鼠皮膚潰瘍的治療作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（12）：2561.

［4］莊建華，周雪雪，卓陽(yáng)，等.胰島素與重組表皮生長(zhǎng)因子復(fù)合凝膠的制備［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2012，24（7）：739.

［5］羅志軍，黎洪棉，王和庚，等.外用重組人表皮生長(zhǎng)因子聯(lián)合殼聚糖創(chuàng)面修復(fù)膜凝膠治療面部Ⅱ度燒傷的療效觀察［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（1）：112.

Development of Chitosan-gelatin for Diabetic Foot

ZHU Ye-jing
Department of Pharmacy，Heze Municipal Hospital，Heze，Shandong Province，274031 China

Objective To study the preparation process of chitosan-gelatin for diabetic foot so as to formulate the quality control method.Methods Chitosan and recombinant human epidermal growth factor were used as the materials for the preparation of chitosan-gelatin for diabetic foot.And rat scald model was used to evaluate the effect of chitosan-gelatin for repairing the wound.Results The preparation process of chitosan-gelatin is simple with stable quality.The chitosan-gelatin has significant effect on the skin scald in rats.Conclusion The chitosan-gelatin meets the provisions of the regulations about gelata of Pharmacopoeia of the People’s Republic of China with good application prospect in the treatment of diabetic foot. ［Key words］Diabetic foot；Chitosan；Gelatin；Preparation method；Ulcer healing

R587.1

A

1672-4062（2015）12（b）-0019-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2015.24.019

2015-09-21）

朱業(yè)靖（1977.2-），男，山東菏澤人，碩士，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)。