雜色鮑血細胞分類、結構和免疫功能的流式細胞術分析

冼健安 , 錢 坤, 郭 慧, 王冬梅 張秀霞 苗玉濤, 潘訓彬, 王安利

(1. 中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所, 海南 海口 571101; 2. 華南師范大學 生命科學學院, 廣東省水產健康安全養殖重點實驗室, 生態與環境科學廣東普通高校重點實驗室, 廣東 廣州 510631; 3. 廣東海洋大學 水產學院, 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國南方重要的名貴海水水產品。近年來, 由于鮑類疾病的肆虐,鮑類養殖業遭受嚴重的經濟損失, 迫切需要對鮑類的免疫及病理學進行深入研究。鮑類只有先天性異性免疫功能, 血細胞在其細胞免疫和體液免疫過程中均起著十分重要的作用, 如對病原體進行吞噬和包裹, 釋放各類抗菌因子等[1]。目前鮑類血細胞的研究仍相對滯后, 主要還集中在血細胞的分類和結構研究上[2-5], 對各類血細胞的具體功能和相互協同作用仍知之甚少。研究滯后的其中一個主要原因是受限于研究技術, 對血細胞在細胞水平上的研究一直依賴于各類顯微鏡。流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是早在 20世紀 70年代發展起來的,對細胞的物理和化學性質進行快速檢測的技術, 具有客觀準確、快速、同時測定多個指標等優點, 在臨床上的應用已十分廣泛, 近年來已逐步應用到水產無脊椎動物如蝦類[6-8]和雙殼類[9-12]的研究中, 但在鮑類血細胞上的研究仍甚少[13-14]。本研究應用FCM 分析雜色鮑血細胞的分類、結構和免疫功能,為進一步研究鮑類血細胞免疫以及病害防治研究提供基礎資料, 并建立一套快捷、準確的鮑類血細胞指標的FCM檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)購自廣州黃沙水產品市場, 規格為殼長 6～7cm, 于實驗室海水(鹽度 30, 溫度 20～22℃)中充氣暫養 1周, 暫養期間定時投喂海帶, 清理殘餌和糞便。

二乙酸熒光素(FDA)和 2’, 7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)購自 Sigma公司, Annexin VFITC/PI(碘化丙啶)凋亡檢測試劑盒、LysoTracker Red、MitoTracker Green和黃綠色熒光微球(yellow-green fluorescent carboxylate-modified FluoSpheres?beads, 直徑1 μm)購自Invitrogen公司, 其他試劑為國產分析純。

1.2 血細胞懸液的制備

采用腹足創傷法取鮑血淋巴, 用過濾無菌海水以1∶1稀釋, 此時細胞密度約為106個/mL。共測定10只鮑, 每個個體的稀釋血淋巴作為一單獨樣品進行測定。

1.3 流式細胞儀

流式細胞儀為美國 BD(Becton Dickinson)公司FACSCalibur, 應用 CellQuest軟件進行實驗數據的獲取和分析。前向角散射光(Forward light scatter,FSC)反映細胞大小, 側向角散射光(Side light scatter,SSC)反映細胞顆粒復雜度; FITC(異硫氰酸熒光素)、MitoTracker Green、黃綠色熒光微球、FDA和DCF(2’, 7’-二氯熒光黃)的綠色熒光用第一熒光通道(FL1)檢測, PI和LysoTracker Red的紅色熒光用第二熒光通道(FL2)檢測。

1.4 血細胞分類與組成比例

稀釋血淋巴用 200目篩網過濾后直接上機進行檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。以SSC為橫坐標、FSC為縱坐標作散點圖, 在SSC-FSC散點圖上設門劃分各個細胞亞群, 分析各類血細胞所占的比例。

1.5 血細胞凋亡率

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測血細胞的自然凋亡率。血淋巴取出后, 立即進行離心然后重懸于1x Annexin V結合緩沖液中, 調整細胞濃度約 3×106個/mL, 每 100 μL血細胞懸液加入 5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液, 避光染色15 min,再加入400 μL 1x Annexin V結合緩沖液, 200目篩網過濾后立即上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以Annexin V-FITC熒光強度(FL1)為橫坐標, PI熒光強度(FL2)為縱坐標的散點圖顯示。如圖 2, 用十字門劃分各類細胞的區域: 活細胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于象限 a, 前期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于象限b, 后期凋亡細胞和死細胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于象限c, 分析各象限細胞占總細胞數的比例。細胞總凋亡和死亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細胞(象限b+c)所占的比例。為避免血細胞離體時間過長對結果造成影響,從樣品制備到上樣的整個過程應盡量控制在30 min以內。

1.6 吞噬活性

以黃綠色熒光微球作為被吞噬物測定血細胞的吞噬活性。分別取血細胞懸液 400 μL, 加入 10 μL濃度為 1/10的微球稀釋液, 室溫避光孵育 1 h, 用200目篩網過濾后上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以FL1熒光量為橫坐標, 細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示, 以標尺劃定吞噬微球的區域, 分析吞噬不同數量微球的細胞占總細胞數的比例。

1.7 線粒體數量

應用MitoTracker Green作為線粒體的特異性熒光探針, MitoTracker Green對于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。取血細胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L MitoTracker Green室溫避光孵育30 min, 用200目篩網過濾后上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以MitoTracker Green熒光量(FL1)為橫坐標, 細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示。根據 SSCFSC散點圖中劃分的血細胞亞群, 作不同類型血細胞的MitoTracker Green直方圖, 分析不同類型血細胞的 MitoTracker Green平均熒光量, 細胞的 Mito-Tracker Green熒光量與線粒體數量成正比。

1.8 溶酶體數量

應用LysoTracker Red作為溶酶體的特異性熒光探針, 它是DND99進行了熒光標記的帶有弱堿性的熒光探針, 可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中, 從而實現對于溶酶體的特異性熒光標記。取血細胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L LysoTracker Red室溫避光孵育60 min, 用200目篩網過濾后上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以LysoTracker Red熒光量(FL2)為橫坐標, 細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示。根據SSC-FSC散點圖中劃分的血細胞亞群,作不同類型血細胞的 LysoTracker Red直方圖, 分析不同類型血細胞的 LysoTracker Red平均熒光量, 細胞的LysoTracker Red熒光量與溶酶體數量成正比。

1.9 非特異性酯酶活性

以FDA為標記探針檢測非特異性酯酶活性的變化。取血細胞懸液200 μL, 加入5 μmol/LFDA室溫避光孵育30 min, 經200目篩網過濾后上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以FDA熒光量(FL1)為橫坐標, 細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示。根據SSC-FSC散點圖中劃分的血細胞亞群,作不同類型血細胞的FDA直方圖, 分析不同類型血細胞的FDA平均熒光量, 細胞的FDA熒光量與非特異酯酶活性成正比。

1.10 活性氧(ROS)含量

以DCFH-DA為標記探針檢測ROS含量的變化。取血細胞懸液200 μL, 加入10 μmol/LDCFH-DA室溫避光孵育30 min, 經200目篩網過濾后上機檢測, 每個樣品的細胞獲取數為10 000個。結果以DCF熒光量(FL1)為橫坐標, 細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示。根據SSC-FSC散點圖中劃分的血細胞亞群, 作不同類型血細胞的DCF直方圖, 分析不同類型血細胞的DCF平均熒光量, 細胞的DCF熒光量與ROS含量成正比。

1.11 統計分析

結果顯示為平均值±標準差(Mean ± SD), 實驗數據利用 SPSS 13.0進行 Tukey單因素方差分析,P＜0.05確認為差異性顯著。

2 結果

2.1 血細胞分類與組成比例

圖1A為血細胞散點圖, 圖1B為等高圖。在等高圖中, 細胞密度相同的點連成一環線, 處于中央位置的閉合等高線圈為某類細胞最集中的區域, 據此定義為一類細胞, 將該區域進行劃定。如圖1所示,根據血細胞FSC和SSC特征的不同, 可把雜色鮑血細胞劃分為三個亞群: R1, R2和R3。亞群R1的FSC和 SSC值都相對最小, 表明該亞群的細胞最小, 顆粒復雜度也最低, 為透明細胞; R3亞群細胞的 FSC和 SSC值都相對最大, 表明該亞群的細胞最大, 顆粒復雜度也最高, 為大顆粒細胞。R2亞群的細胞大小和顆粒復雜度處于R1和R3亞群之間, 為小顆粒細胞。各類細胞的FSC和SSC強度見表1, 不同個體的大顆粒細胞的比例有較大的差異, 如圖 1所示,A圖的大顆粒細胞(R3)較少, B圖的較多; 其組成比例的結果見表2, 順序為: 小顆粒細胞＞透明細胞＞大顆粒細胞, 三類細胞之間的比例存在顯著差異(P＜0.05)。

2.2 細胞凋亡率

圖1 雜色鮑血細胞SSC-FSC散點圖(A)和等高圖(B)Fig.1 SSC-FSC dot plot (A)and contour plot (B)of H. diversicolor hemocytes

表1 雜色鮑3類血細胞的大小和顆粒復雜度(A.U.)Tab.1 Size and granular complexity of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

圖2為雜色鮑新鮮血細胞Annexin V-FITC/PI凋亡染色散點圖。測定了10只雜色鮑的血細胞自然凋亡率, 結果見表3, 其平均總凋亡和死亡率為3.76%。

表2 雜色鮑3類血細胞的組成比例(%)Tab.2 Proportion of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (%)

圖2 雜色鮑血細胞Annexin V-FITC/PI染色凋亡散點圖Fig.2 Apoptosis dot plot of H. diversicolor hemocytes stained with Annexin V-FITC and PI

表3 雜色鮑血細胞凋亡率(%)Tab.3 Apoptotic ratio of H. diversicolor hemocytes (%)

2.3 吞噬活性

雜色鮑血細胞吞噬熒光微球的直方圖如圖 3所示, 從圖上可以清晰區分吞噬1個、2個、3個及以上熒光微球的血細胞, 第一個峰為吞噬 1個熒光微球的血細胞(記為 M1), 第二個峰為吞噬 2個熒光微球的血細胞(記為 M2), 其后為吞噬 3個及以上熒光微球的血細胞(記為M3), M4為吞噬了1個及以上熒光微球的血細胞。血細胞的吞噬活性如表4所示, 吞噬1個微球的血細胞占22.31%; 吞噬2個微球的血細胞占16.39%, 個體差異較大, 最低只有8.17%, 最高可達 21.76%; 吞噬 3個及以上微球的血細胞占24.96%; 總吞噬率為63.67%。

圖3 雜色鮑血細胞吞噬熒光微球的直方圖Fig.3 Distribution histogram of H. diversicolor hemocytes phagocytosed fluorescent beads

表4 雜色鮑血細胞的吞噬活性(%)Tab.4 Phagocytic activity of H. diversicolor hemocytes (%)

2.4 線粒體數量和溶酶體數量

結果如表 5所示, 線粒體和溶酶體的數量均在大顆粒細胞中最多, 小顆粒細胞次之, 透明細胞最少。大顆粒細胞的線粒體數量約為小顆粒細胞的3.4倍, 透明細胞的 10.4倍; 大顆粒細胞的溶酶體數量約為小顆粒細胞的3.7倍, 透明細胞的10.2倍。三類細胞線粒體數量和溶酶體數量均存在顯著差異(P＜0.05)。

表5 雜色鮑3類血細胞的生理特征Tab.5 Physiological characteristics of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

2.5 非特異性酯酶活性和ROS含量

結果如表 5所示, 酯酶活性在大顆粒細胞中最高, 小顆粒細胞次之, 透明細胞最低; 大顆粒細胞約為小顆粒細胞的1.2倍, 透明細胞的5.3倍。ROS含量在大顆粒細胞中最多, 小顆粒細胞次之, 透明細胞最少; 大顆粒細胞約為小顆粒細胞的2.7倍, 透明細胞的17.1倍。三類細胞線粒體數量和溶酶體數量均存在顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

3.1 鮑類血細胞的分類

對于鮑類血細胞的分類, 目前仍沒有統一的標準。根據細胞含有顆粒的情況以及細胞大小, 可以基本分為兩大類: 顆粒細胞和無顆粒細胞(或稱透明細胞)。王江勇等[5]根據細胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑血細胞分為顆粒細胞和無顆粒細胞。張劍誠等[15]也將皺紋盤鮑(H. discus hannai)血細胞分為顆粒細胞和透明細胞兩大類。Sahaphong等[16]應用光鏡和電鏡觀察認為耳鮑(H. asinina)血細胞可分為顆粒細胞和透明細胞。饒小珍等[3]把九孔鮑(H. diversicolor supertexa)血細胞分為大細胞、中等細胞和小細胞; 透射電鏡下血細胞可分為兩類: 顆粒細胞對應于光鏡下的大細胞和中等細胞; 無顆粒細胞對應于光鏡下的小細胞。有的學者根據血細胞的一些超微結構特征, 將血細胞類型分得更為細致。李太武等[2]觀察雜色鮑血細胞的超微結構, 認為除了顆粒細胞和透明細胞外, 還有一種胞質電子密度高、數量最少的小細胞。陳全震等[4]通過對皺紋盤鮑血細胞的超微結構的觀察, 將顆粒細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞和特殊顆粒細胞, 無顆粒細胞分為透明細胞和淋巴樣細胞。一些外國學者只觀察到少量顆粒細胞, 有的研究甚至沒有發現顆粒細胞。Travers等[17]應用顯微觀察和流式細胞術對歐洲鮑(H. tuberculata)血細胞進行了分類研究, 均認為其血細胞主要由透明細胞和漿樣細胞組成, 只發現有極少量的顆粒細胞,其中漿樣細胞占 10%。Donaghy等[14]也應用顯微觀察和流式細胞術對盤鮑(H. discus discus)血細胞分類進行了研究, 結果認為血細胞由透明細胞和漿樣細胞組成, 應用此兩種方法得出漿樣細胞所占比例分別為3.82%和6.75%。本研究應用流式細胞術, 根據血細胞大小和顆粒復雜度的差異, 可將血細胞清晰地分為三個類群: 大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞, 與饒小珍等[3]對九孔鮑研究的結果相似。比較流式細胞術和顯微觀察兩種分類方法, 顯微觀察需要對血細胞進行染色處理, 染色效果對后續觀察有較大的影響, 血細胞類型的鑒定也受觀察者的主觀判定影響。相對而言, 流式細胞術檢測量大, 數據較為客觀、準確, 還具有快速簡便、可同時進行計數或熒光分析等優點, 但關于血細胞類型的劃定, 對研究人員的分析水平要求也較高。

3.2 鮑類血細胞的組成比例

對于鮑類血細胞的組成比例, 以往的研究結果也存在一定的差異。王江勇等[5]研究認為雜色鮑的顆粒細胞和無顆粒細胞分別占55.1%和44.9%; 張劍誠等[15]測得皺紋盤鮑的顆粒細胞和透明細胞分別占40%和 60%; 饒小珍等[3]觀察得出九孔鮑的大細胞(顆粒細胞)、中等細胞(顆粒細胞)和小細胞(無顆粒細胞)分別占3.6%、91.7%和4.7%; 本研究分析得出雜色鮑的大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞分別占8.55%、58.17%和32.71%。

不同類型的血細胞在功能上存在一定的差異,血細胞組成比例可能反映了機體的不同生理和免疫狀態。研究發現雜色鮑經病毒注射感染后, 其顆粒細胞比例從初始的55%到感染6 h后增加至67%, 然后逐漸下降, 至感染36 h降到45%; 而無顆粒細胞從初始的45%下降到感染6 h 的33%, 然后逐漸增加,至感染36 h升至55%[18]。因此, 以往的研究得到差異較大的結果, 可能與物種種類、大小、環境因素和健康狀態等有關。

3.3 血細胞的結構

血細胞結構的差異是區分不同類型血細胞的主要依據之一。李太武等[2]應用電鏡觀察發現雜色鮑顆粒細胞的胞質電子密度較高, 含有較多顆粒以及細胞器, 如線粒體、內質網、高爾基體、溶酶體等, 而透明細胞的細胞器較少。饒小珍等[3]也發現九孔鮑的顆粒細胞胞質含有豐富的細胞器, 有較多的線粒體、內質網等, 而無顆粒細胞則只有少量線粒體和粗面內質網。本研究中, 應用特異性的探針對血細胞的線粒體和溶酶體進行標記從而分析其數量, 結果顯示這兩類細胞器均在大顆粒細胞中最多, 小顆粒細胞次之, 透明細胞中最少, 與以往超微觀察的研究報道一致[2-3]。細胞器的多寡從側面反映了各類血細胞在功能上也存在差異。兩類顆粒細胞的線粒體較多, 表明它們的生理代謝過程更為活躍, 包括免疫酶類的合成、吞噬作用以及脫顆粒等耗能過程; 較多的溶酶體表明兩類顆粒細胞對異物、病原體以及壞死細胞等的清除能力更強, 在免疫過程中擔當更為重要的角色。

3.4 血細胞的免疫功能

細胞凋亡是機體正常細胞在受到生理和病理性刺激后出現的一種自發的死亡過程。本研究發現, 正常雜色鮑的血細胞中也可檢測到一定的凋亡細胞, 這是機體正常新陳代謝的表現, 在蝦類的研究中也有相似的結果[7]。另有研究發現, 貝類在受到環境污染物脅迫后,血細胞會受到毒性損傷, 從而被誘導發生凋亡[12,19],雖然細胞凋亡是機體清除損傷細胞的重要過程, 但血細胞凋亡率的持續上升可能會引起血細胞數量的下降,從而導致機體免疫力下降, 甚至危及生命[20]?？梢? 血細胞凋亡在環境毒理學和免疫學研究中都是一個重要的敏感指標, 在往后的研究中可加以重視。

吞噬作用是血細胞的主要免疫功能之一, 對異物、病原體以及自身的壞死細胞、碎片等進行清除。由于流式細胞術具有準確、快捷、重復性高等優點, 已被應用于多種貝類血細胞吞噬作用研究中[9,13-14,21]。本研究根據預實驗所建立的測定條件, 對雜色鮑血細胞的總體吞噬情況進行分析, 結果顯示總吞噬率為 54.32%～75.17%, 吞噬一個微球的血細胞占15.74%～28.80%。有的國外學者認為為了減少非特異性粘附所帶來的誤差, 應以吞噬三個及以上微球的血細胞的比例來衡量吞噬活性[9,14,21], 本研究中測得該比例達到了 20.03%～31.64%, 可見本研究的測定條件同樣適用于此衡量標準。大部分貝類研究報道認為吞噬作用主要由顆粒細胞完成, 透明細胞也具有一定的吞噬能力[22-23]。在本研究中, 由于血細胞進行吞噬作用, 細胞發生了變形, 其大小和顆粒度發生不同程度的改變, 另外由于吞噬過程被激活,血細胞的脫顆粒免疫反應也可能被進一步激活, 也對血細胞的大小和顆粒復雜度產生影響, 從而在FSC-SSC散點圖中難以區分各類血細胞, 因此本研究未能對不同類型血細胞的吞噬活性進行分析。

非特異性酯酶普遍存在于各類細胞中, 是溶酶體酶類之一, 參與對異物、病原體的殺傷及清除。細胞化學研究顯示九孔鮑各類血細胞中均含有非特異性酯酶, 總陽性率達 86.3%[3]。本研究通過流式細胞術分析, 也表明雜色鮑各類血細胞均具有非特異性酯酶活性, 且在各類血細胞中存在差異, 兩類顆粒細胞顯著高于透明細胞, 此結果與溶酶體數量的結果相吻合。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子(O2–)、過氧化氫( H2O2)和羥自由基(·OH)等, 是機體進行防御殺菌的重要物質。血細胞在自然生理條件下也存在一定量的ROS, 當病菌入侵時, ROS含量會迅速上升, 以進行免疫殺菌, 此過程稱為呼吸爆發[23]。研究表明鮑類血細胞經細菌、病毒或抗原物質刺激后, 均會產生大量的ROS進行免疫防御[15,18,24]。本研究對自然生理狀態下雜色鮑各類血細胞的非誘導性 ROS含量進行比較, 結果顯示大顆粒細胞的 ROS含量最多, 小顆粒細胞次之, 透明細胞最少。線粒體數量、溶酶體數量、非特異性酯酶以及ROS含量均得到了一致的結果, 表明兩類顆粒細胞在鮑類的免疫防御過程中可能發揮更為重要的作用。

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