飼用糞腸球菌培養基及發酵條件的優化研究

馬明侖，宋志元，張新蕾，張要齊，張軍輝，孫雪峰

（1.新鄉市畜產品質量監測檢驗中心，河南 新鄉　453700；2.河南惠通天下生物工程有限公司）

飼用糞腸球菌培養基及發酵條件的優化研究

馬明侖1，宋志元2，張新蕾2，張要齊2，張軍輝2，孫雪峰2

（1.新鄉市畜產品質量監測檢驗中心，河南 新鄉453700；2.河南惠通天下生物工程有限公司）

為提高飼用糞腸球菌發酵活菌數，通過單因素試驗和正交優化試驗對糞腸球菌的培養基和發酵條件進行優化。確定最佳發酵培養基為蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖2.8%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%。最佳發酵條件為培養基初始pH（7.1i 0.1），接種量2.5%～5.0%，溫度34～37℃，150 r/min振蕩培養。在最佳培養基和發酵條件下，糞腸球菌活菌數最高可達8.5 109cfu/ml。

糞腸球菌；發酵；正交試驗；優化

隨著科技的進步和人們對健康、綠色畜禽產品的需求，益生菌作為抗生素的替代品越來越受到人們的關注及深入研究［1］。

糞腸球菌是革蘭氏陽性菌，1994年出版的《伯杰氏細菌鑒定手冊》將該菌列為腸球菌屬［2］。糞腸球菌存在于人和大多數動物的腸道內，是人體腸道內的重要菌群，能耐受胃酸和膽汁酸的作用［3］。糞腸球菌制作成微生態飼料添加劑，可以對宿主胃腸道進行微生態調節，增強動物免疫力［4］，不僅具有提高畜禽生產性能和防治疾病的作用，而且還具有無污染、無耐藥性和無殘留等優點。該研究通過對培養基和發酵工藝進行優化，以提高糞腸球菌的活菌數，為糞腸球菌制劑工業化生產提供技術支撐。

1　試驗材料

1.1菌種

糞腸球菌，購于中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2培養基

檢測培養基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，吐溫-80 1 ml/L，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸三銨0.2%，無水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，無水乙酸鈉0.5%，溴甲酚紫0.006%，瓊脂1.5%，pH（7.1i 0.1）。

種子培養基：蛋白胨2%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，吐溫-80 1 ml/L，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，無水乙酸鈉0.5%，pH（7.1i 0.1）。

基礎發酵培養基：蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖3.4%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%，pH（7.1i 0.1）。

2　試驗方法

2.1糞腸球菌種子培養及發酵

種子培養：以0.5%的接種量，將斜面種子接種至種子培養基中，37℃靜置培養10 h，即為種子液。

發酵：以5%的接種量，將種子液接種至發酵培養基中，37℃，振蕩培養至碳酸鈣消失。

2.2發酵培養基的優化

2.2.1碳酸鈣含量的確定

將碳酸鈣以0%、0.5%、0.8%和1.0%的添加量添加至發酵培養基中，根據碳酸鈣消失情況和活菌數選取最優碳酸鈣含量。

2.2.2正交優化試驗

選取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等3個影響因素，采用L9（34）正交表設計試驗，以發酵液糞腸球菌活菌數為指標，確定葡萄糖、蛋白胨和酵母粉的添加量（見表1），每次處理3個重復。

表1　正交試驗的因素和水平

2.3發酵條件的優化

2.3.1培養方式對發酵的影響

分別以靜置、100 r/min、150 r/min進行發酵，根據碳酸鈣消失情況和活菌數確定培養方式。

2.3.2培養基初始pH對發酵的影響

用3 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節發酵培養基初始pH分別為6.6、7.1、7.6，發酵完成后，根據碳酸鈣消失情況和活菌數確定最佳初始pH。

2.3.3發酵溫度對發酵的影響

分別在33℃、37℃、41℃溫度條件下，進行發酵，根據碳酸鈣消失情況和活菌數確定最佳發酵溫度。

2.3.4接種量對發酵的影響

分別以2.5%、5.0%和10%的接種量，將種子液接種至發酵培養基中，發酵完成后，根據碳酸鈣消失情況和活菌數確定最佳接種量。

2.3檢測方法

2.3.1pH檢測

用pH計直接檢測發酵，記錄結果。

2.3.2吸光度檢測

將發酵液稀釋適宜濃度，以稀釋相同倍數的空白培養基作對照，在600 nm處測稀釋發酵液的吸光值，使數值在0.2～0.8之間，記錄結果。

2.3.3活菌數的檢測

用無菌生理鹽水稀釋發酵液至適宜濃度，吸取0.1 ml至活菌計數平板上，涂布均勻，37℃倒置培養36～48 h，記錄結果。

3　結果

3.1發酵培養基優化結果

3.1.1碳酸鈣含量對發酵的影響（見圖1）

如圖1所示，發酵培養基中不添加碳酸鈣時，發酵情況較差，活菌數非常低。當添加0.5%、0.8%和1.0%的碳酸鈣時，發酵液中活菌數均較高，但碳酸鈣含量為1.0%，發酵14 h時，碳酸鈣含量仍未消失完全；碳酸鈣含量為0.5%和0.8%時，碳酸鈣均消失。故選擇碳酸鈣含量為0.5%。

圖1　碳酸鈣含量對糞腸球菌發酵的影響

3.1.2正交試驗結果（見表2）

表2表明，各因素對于正交優化試驗的影響順序依次為：蛋白胨＞葡萄糖＞酵母粉，最佳組合為B2A1C2，即葡萄糖添加量為2.8%，蛋白胨添加量為3.2%，酵母粉添加量為1.0%。

表2　正交試驗的設計與結果

3.2發酵條件的優化

3.2.1培養方式對發酵的影響

在靜置或100 r/min的發酵條件下，發酵液中碳酸鈣均未消失，且活菌數較低；而在150 r/min的發酵條件下，發酵液中碳酸鈣均已消失，活菌數也較高。

3.2.2培養基初始pH對發酵的影響（見圖2）

圖2所示，當初始pH較高時，發酵液中活菌數較低；初始pH為7.1時，發酵液中活菌數較高，達到74億/ml以上。故確定培養基初始pH為7.1i 0.1。

圖2　培養基初始pH對糞腸球菌發酵的影響

3.2.3溫度對發酵的影響（見圖3）圖3所示，發酵溫度為40℃時，發酵液活菌數較低；發酵溫度為34℃和37℃時，發酵液活菌數分別達68億/ml和70.8億/ml，差別不大，故發酵溫度可控制在34～37℃。

3.2.4接種量對發酵的影響（見圖4）

圖4所示，接種量為2.5%和5.0%時，發酵液的吸光度和活菌數差別不明顯，OD600為0.79左右，活菌數達75億/ml左右。而接種量為10.0%時，發酵液的吸光度和活菌數均較低。故確定接種量為2.5%～5.0%。

發酵液初始活菌數對發酵結束后活菌數的影響（見圖5）。結果顯示發酵液初始活菌數每毫升為0.48億～1.15億時，發酵結束后活菌數均達到70億/ml以上；其中發酵液初始菌數為0.99億/ml時，發酵結束后活菌數達到85億/ml。

圖3　溫度對糞腸球菌發酵的影響

圖4　接種量對糞腸球菌發酵的影響

4　結論

圖5　初始活菌數對糞腸球菌發酵的影響

通過對發酵培養基和發酵條件進行優化，確定糞腸球菌最佳發酵培養基配方為蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖2.8%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%，初始pH（7.1i 0.1）。采用最佳發酵培養基、初始pH（7.1i 0.1）、接種量2.5%～5.0%、溫度34～37℃，以150 r/min振蕩培養，發酵液中糞腸球菌活菌數最高可達8.5 109cuf/ml以上。

［1］劉虎傳，張敏紅，姜海龍.益生腸球菌的研究進展［J］.動物營養學報，2011，23（12）：2090-2096.

［2］Hot G J，Krieg R N，Sneath H A P，等.伯杰氏細菌鑒定手冊·第9版［M］.北京：科學出版社，l994.

［3］沈中艷.豬源益生乳酸菌的篩選及發酵工藝研究［D］.碩士學位論文.武漢：華中農業大學，2007：10-18.

［4］王旭明，陳宗澤，袁毅.益生菌作用機理的研究進展［J］.吉林農業科學，2002，27（1）：50-53.

S816

B

1004-5090（2015）06-0004-03

2015-04-18）