新城疫病毒檢測方法的研究進展

楊麗麗　鄒冬輝

摘要：新城疫是由新城疫病毒（NDV）引發禽類的烈性、急性、高度接觸性疾病，禽類感染NDV后的死亡率可達 100%，國際獸疫局（OIE）將其列為動物A 類疫病。因此，對新城疫病毒進行簡便、快速、準確的檢測具有重要意義。本文從病毒分離及鑒定、免疫血清學檢測、分子生物學檢測、量子點技術、熒光微球檢測技術方面闡述了NDV檢測技術進展，以期為臨床和科研工作者提供一定的參考。

關鍵詞：新城疫病毒；檢測；進展

中圖分類號： S852.65 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.19.049

NDV 在全球范圍內分布廣泛，上百種禽類對 NDV 可以實驗室感染或自然感染，同時還有大量的其他種類動物疑似被感染[1]。在1926 年新城疫首次在印度尼西亞的 Java[2]和英國的新城[3]暴發。90年代后，該病在亞洲多個國家發生，給禽類養殖業帶來了巨大損失。因此，世界各國十分重視該病的發生和流行，NDV快速而準確的檢測具有重要意義。目前用于檢測NDV的技術手段種類繁多，現主要介紹以下幾種：

1病毒的分離鑒定

該方法診斷疫病確切，同時可定性感染的毒株。通過將病毒接種SPF雞胚的方法進行分離，應用血液凝集試驗和血液凝集抑制試驗對病毒進行鑒定。該試驗方法的準確性和敏感性高，重復性好，特異性強，但其存在高成本、長時間等不足之處，所以不適合該病的快速診斷。

2血清學技術

2.1酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯免疫吸附試驗是通過物理方法將抗原或抗體吸附在固相載體上，然后測定免疫酶。該方法是目前研究最多最廣泛的一門技術方法，其優點主要是程序自動化，可快速獲取結果，花費少。盧建紅[4] 、吳長新[5]、陳昌海[6]、吳紅專[7]、蔣鳳英[8]等建立了多種ELISA方法對新城疫病毒的檢測。研究結果顯示了該項技術高度的特異性和敏感性、安全、便捷、快速。

2.2 免疫熒光抗體技術

該方法是將熒光素如異硫氰酸（FITC）標記抗體，然后用熒光顯微鏡觀察熒光以分析示蹤相應的抗原或抗體的方法[9]。該種方法具有快速、準確、簡單的特點。劉建宏[10]等用熒光標記的單克隆抗體對病例雞的NDV抗原進行檢測，實驗結果表明免疫熒光技術的準確、快速。

2.3免疫膠體金電鏡技術

該方法是一種新型的免疫標記技術，以膠體金為標志物應用到抗原抗體。標記物制備簡便，方法特異、敏感，無放射性同位素、酶顯色底物，不需要熒光顯微鏡，其應用前景廣泛。薛擁志[11]等應用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒標記NDV抗體，用直接電鏡、免疫電鏡和膠體金免疫電鏡技術比較觀察新城疫病毒。實驗證明膠體金電鏡技術作為檢測NDV的檢測方法具有簡單、準確和快速等優點。

3分子生物學技術

3.1熒光定量RT-PCR 技術

熒光定量RT-PCR 技術檢測新城疫病毒的方法應用的是 TaqMan 技術[12]，通過熒光標記的特異性探針來標記跟蹤PCR產物。其方法比常規的檢測方法用時少、周期短、靈敏、準確、特異性強、操作簡便等。屈素潔[13]等通過構建重組陽性標準質粒的方法，建立檢測NDV核酸的熒光定量PCR方法，其實驗方法實現了對新城疫的定量檢測。

3.2基因芯片技術

基因芯片技術是近年來基于分子生物學技術發展起來的一種檢測技術，該方法是將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析。耿捷[14]等根據新城疫病毒基因序列設計了30條寡核苷酸探針芯片，通過對NDV的檢測說明芯片的穩定性、特異性和敏感性較好，成本低廉，方法簡單。為新城疫的檢測提供了新方法，適合新城疫病毒的快速檢測。

4量子點檢測技術

量子點是最近幾年發展起來的一種新型熒光材料，具有穩定性、生物相容性好等特點，目前已成為病原檢測的新型工具。房保海[15]等應用量子點建立了檢測新城疫病毒的新方法，以生物素標記的抗NDV單克隆抗體為檢測抗體，NDV的多克隆抗體為捕捉抗體，量子點標記的鏈霉親和素為熒光探針。試驗結果表明，該方法與其他禽類疫病無交叉反應，試驗靈敏，為臨床早期快速檢測NDV提供了新手段。

5免疫熒光微球技術

熒光微球是指直徑在納米至微米級范圍內，負載有熒光物質，受外界能量刺激時能激發出熒光的一種固體顆粒[16]。將熒光微球與流式細胞術相結合，形成一種新型的分析檢測系統。應用一種激光光源激發出三種不同的波長，當三種波長同時被檢測出來時，就可確定其中一種相應的被檢測物質的存在。其優點是靈敏度高、特異性強、分析速度快，僅微量樣品就可進行多組分同時分析[17]。筆者應用熒光微球技術實現了對新城疫病毒和禽流感病毒的快速檢測[18-19]。該方法的特異性、敏感性和重復性較好。

近年來，隨著新城疫疫情的發生發展，更加便捷、快速、高通量的檢測方法一定會被研制出來，為動物疫情的控制與消滅提供強大的科學技術手段。

參考文獻

[1] Alexander， D.J. Newcastle disease and other paramy

xoviridae infections[A]. Calnek， B.W. （Ed.） Diseases of Poultry[C].10th Ed. Mosby-Wolfe， London， pp. 1997：541-569.

[2]Kraneveld，F.C.A poultry disease in the Dutch East

Indies[J].Ned Indisch BI Diergeneesk，1926（38）：448-450.

[3]Doyle，T.M.A hitherto unrecorded disease of fowls

due to a filter-passing virus[J].JComp Pathol Ther， 1927（40）：144-169.

[4] 盧建紅，張如寬，焦新安，等.抗新城疫病毒單抗夾心PEG-ELISA建立及其初步應用[J].中國獸醫科技，1994，24（03）：1-3.

[5] 吳長新，張之友，徐福亮，等.應用新城疫診斷試劑盒快速診斷非典型雞新城疫的研究[J].江蘇農學學報，1997，18（01）：6-8.

[6] 陳昌海，張如寬，劉秀梵.用單抗夾心ELISA自免疫雞群檢測新城疫強度[J].中國畜禽傳染病，1993（04）：28-31.

[7] 吳紅專，張如寬，劉秀梵.新城疫單抗ELISA試劑盒的研制及其初步應用[J].中國獸醫科技，1995，25（06）：3-6.

[8]蔣鳳英，胡建華，倪建平，等.單抗夾心ELISA檢測免疫雞群新城疫病毒[J].上海交通大學學報，2004，22（03）：286-287.

[9]劉宇，徐春志，岳筠，等.新城疫病毒檢測技術研究進展[J].畜牧獸醫科學信息，2007，（08）.

[10]劉建宏，王標，莊向生.單克隆抗體檢測新城疫病毒[J].江蘇農學院學報，1990，（18）.

[11]薛擁志，孫繼國，甘永華，等.用膠體金免疫電鏡技術檢測新城疫病毒[J].河北農業大學學報，2003（26）：20-22.

[12] Aldous EW， Collins MS， McGoldrick A .etal. Rapid

pathotyping of Newcastle disease virus （NDV） using fluorogenic probes in a PCR assay[J].Vet Microbiol，2001，80（03）.

[13] 屈素潔，梁媛，韋顯凱，等.熒光定量RT-PCR檢測雞新城疫病毒方法的建立及應用[J].上海畜牧獸醫通訊，2014（03）：19-21.

[14] 耿捷，羅衛，林苗，等.基因芯片技術檢測新城疫病毒[J].黑龍江畜牧獸醫，2004（12）：72-73.

[15] 房保海，孫濤，賈俊濤，等. 基于量子點標記技術的雞新城疫病毒sFLISA檢測技術研究[J]. 山東農業科學，2014，46（05）：118-121.

[16] 汪地強，劉白玲，胡杰，等. 熒光微球的制備及應用[J].高分子材料科學與工程，2004，20（04）：41-45.

[17] Lizard G.， Monier S.， Prunet C.， Duvillard L.， Gambert P.. Annales De Biologie Clinique， 2004（62）： 47-52.

[18]楊麗麗，王振國，王明泰，等.新城疫病毒流式微球免疫檢測新方法[J].分析化學，2008，1（36）：29-33.

[19]楊麗麗，王曉娥，李占東.應用熒光微球檢測禽流感病毒的初步研究[J].天津農業科學，2015，21（08）：31-33.

作者簡介：楊麗麗，碩士，吉林工程技術師范學院食品工程學院，講師，研究方向：食品微生物檢測。