南極磷蝦自溶過程蛋白質組分含量變化

黃顯彬，曹 榮，李智博

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116000；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071）

南極磷蝦（Euphausia superba）屬于無脊椎動物中的節肢動物門、甲殼綱、軟甲亞綱、磷蝦目，廣泛分布于南極水域，生物量達數億t[1]。隨著近海漁業資源的日益減少，南極磷蝦資源受到世界漁業發達國家的廣泛關注，我國也極為重視南極磷蝦的開發，并于2009年開始對南極磷蝦進行商業捕撈和加工利用[2]。

南極磷蝦富含優質蛋白，但體內含有活性很高的蛋白酶系[3]，南極磷蝦起捕后會迅速發生自溶。因此，南極磷蝦捕撈后需立即冷凍或加工，但是遇到捕撈量集中的情況，南極磷蝦往往得不到及時處理，會導致原料品質劣化[4]，造成經濟損失。南極磷蝦蛋白質極易自溶的生物學特性嚴重束縛了資源的高效利用，對南極磷蝦自溶機理與自溶過程的研究一直是國內外科研人員的研究熱點。如遲海等[5]分析了南極磷蝦0、5 和20℃條件下細菌總數、嗜冷菌數、TVB-N和TMA-N 等鮮度指標的變化情況；李學英[6]等對南極磷蝦0～3℃冷藏過程中pH、出肉率、可溶性蛋白等生化指標進行了研究。而目前有關南極磷蝦自溶過程蛋白質組分含量變化的系統研究還較少。

本文研究了南極磷蝦在4℃和20℃條件下非蛋白氮（NPN）、TCA 可溶性蛋白、氨基酸態氮以及TVB-N 等含量的變化情況，旨在進一步探索南極磷蝦自溶規律，為南極磷蝦蛋白的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

南極磷蝦，由“南極磷蝦資源分布與冷鏈技術”項目組于2014年5月在南極48.1 漁業區捕撈，捕撈后迅速保存在-20℃冰柜中，2014年7月運抵實驗室后，繼續保存于-60℃超低溫冰箱中備用。

1.2 儀器設備

DNP-9162 型恒溫培養箱（上海精密試驗設備公司）；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TYS-200 型多功能高速粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；UV-2802 型紫外/可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；DZ-400/2L 型真空包裝機（諸城市廣元包裝機械廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品解凍 凍結的南極磷蝦樣品采用流水方式解凍。具體操作步驟為：凍結的南極磷蝦放入真空包裝袋中，抽真空，之后置于塑料盒中，采用自然流水解凍。以南極磷蝦個體基本分離作為解凍終點。將解凍的南極磷蝦樣品分別置于4℃和20℃培養箱中貯藏，在0、1、2、4、6、8 h 時取樣進行各項指標的測定。

1.3.2 粗蛋白質含量測定 參照GB/T 5009.5-2010[7]，采用凱氏定氮法。

1.3.3 非蛋白氮（NPN）與TCA 可溶性蛋白含量測定 將南極磷蝦按照1 ∶4（m/v）比例均質。準確稱取勻漿液10 g，精確到0.001 g，置于100 m L 離心管中，加入10 m L 10%三氯乙酸（TCA）溶液，振蕩器震蕩1 min，靜置30 min，之后8 500 r/min 離心20 min，取上清液備用。取上清液10 m L，采用凱氏定氮法測定其中的氮元素含量，即為非蛋白氮。取上清液1 m L于試管中，采用雙縮脲法測定TCA 可溶性蛋白含量。

1.3.4 氨基酸態氮含量測定 參照GB/T 5009.39-2003[8]，采用比色法測定。

1.3.5 總揮發性鹽基氮（TVB-N）含量測定 參照SC/T 3032-2007[9]，采用微量擴散法。

1.3.6 數據處理 采用SPSS 17.0 軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦自溶過程中NPN 含量變化

由圖1 可以看出，南極磷蝦初始NPN 值較高，達到5.25 mg/g，占南極磷蝦總氮的20.70%，這與磷蝦原料歷經長時間的冷鏈運輸有關。在4℃和20℃條件下，南極磷蝦NPN 含量都隨著時間的延長而增加。在最初的1 h 內，4℃和20℃兩組的NPN 無顯著差異，從2 h 開始，20℃組的NPN 含量開始顯著高于4℃組（P<0.05），這說明南極磷蝦的自溶酶系在20℃時具有很高的活性，導致蛋白大量降解，至8 h 時已達到12.67 mg/g，占到總氮的49.96%。4℃條件下，NPN含量的增加較為緩慢，8 h 時為8.40 mg/g，占總氮的33.12%，說明低溫在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

2.2 南極磷蝦自溶過程中TCA 可溶性蛋白和氨基酸態氮含量變化

由圖2 可以看出，20℃條件下TCA 可溶性蛋白含量隨時間延長迅速增加，8 h 后，已由初始的13.28 mg/g 增至59.55 mg/g。而4℃條件下，TCA 可溶性蛋白含量增速平緩。這說明隨測試范圍內，蛋白酶系隨溫度的升高而呈現活力增大的趨勢。

氨基酸態氮的變化趨勢與TCA 可溶性蛋白基本一致，但氨基酸態氮的含量較低，初始值為0.05 mg/g，20℃條件下8 h 后也僅為0.14 mg/g，與TCA 可溶性蛋白含量相比顯著偏低（P<0.01），這說明南極磷蝦自溶初期主要是大分子蛋白被降解為肽類，而自溶酶系分解蛋白質產生的游離氨基酸非常有限。

圖1 南極磷蝦在4℃和20℃條件下NPN 含量的變化

圖2 南極磷蝦在4℃和20℃條件下TCA 可溶性蛋白與氨基酸態氮含量的變化

2.3 南極磷蝦自溶過程中TVB-N 含量變化

南極磷蝦TVB-N 初始值為0.08 mg/g。4℃條件下，南極磷蝦在前2 h 之內TVB-N 值變化不大，2 h后緩慢增加，在8 h 后達到0.16 mg/g。20℃條件下，TVB-N 含量在前1 h 內變化不大，1 h 后TVB-N 隨時間延長迅速增加，至8 h 時，已達到0.21 mg/g。我國對水產鮮活品TVB-N 的限量值為<0.30 mg/g，南極磷蝦在20℃條件下8 h 時TVB-N 含量已超過0.20 mg/g，表明實際生產中應盡快加工，避免高溫條件下長時間貯存。

3 討 論

圖3 南極磷蝦在4℃和20℃條件下TVB-N 值的變化

由凱氏定氮法測得南極磷蝦氮元素含量為25.36 mg/g，折合粗蛋白含量為15.85%（濕基計），說明南極磷蝦是一種典型的高蛋白海洋動物，這與Tou 等[10]的研究結果類似。南極磷蝦體內含有活性很高的蛋白酶系，肌肉蛋白易發生自溶降解，生成小分子物質[11]。NPN 是指大分子蛋白質以外的含氮化合物的總稱，既包括蛋白質降解產生的小分子肽類和游離氨基酸，也包含了酰胺類、氨以及銨鹽等含氮化合物[12]，因此適宜作為評判南極磷蝦自溶進程的指標。TCA 可以沉淀大分子蛋白質，分子量小于10 000 的多肽組分則可以溶解在TCA 溶液中，因此TCA 可溶性蛋白含量的變化可以很好的表征南極磷蝦自溶初期蛋白質發生的水解作用。南極磷蝦自溶酶系包含了類胃蛋白酶、羧肽酶A 和類胰蛋白酶，其最適pH 值分別為3.0、6.0 和8.0，最適溫度在40～60℃之間[3]。在0～20℃區間范圍內，蛋白酶系隨溫度的升高而呈現活力增大的趨勢。因此，20℃條件下，南極磷蝦肌肉蛋白被迅速降解，生成大量的肽類，導致TCA 可溶性蛋白的大量增加。而4℃條件下，南極磷蝦蛋白酶系活力受到抑制，多肽的生成量較少。南極磷蝦的腐敗過程可分為兩個階段，第一階段主要為南極磷蝦的自溶水解，自溶酶系分解蛋白質產生小分子肽類、游離氨基酸等組分；第二階段則主要是內源酶和微生物共同作用，產生揮發性的含氮化合物，造成TVB-N、TMA 等含量的大幅增加。TVB-N 是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中蛋白質分解而產生的氨以及胺類等堿性含氮物質[13]。TVB-N 一般隨著鮮度的下降而增加，因此被廣泛作為反映魚、貝、蝦類等水產品腐敗程度的重要指標。

4 結 論

（1）南極磷蝦自溶過程中，NPN 含量隨著時間的延長而增加，8 h 后4℃和20℃試驗組NPN 含量分別為8.40 和12.67 mg/g，分別占到總氮的33.12%和49.96%，表明南極磷蝦具有活力很高的自溶酶系，而低溫可以在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

（2）TCA 可溶性蛋白的變化規律與NPN 基本一致，而氨基酸態氮含量顯著偏低（P<0.01），表明南極磷蝦自溶初期主要是大分子蛋白被降解為肽類，而自溶酶系分解蛋白質產生的游離氨基酸非常有限。

（3）南極磷蝦TVB-N 值同樣隨著時間延長而增加，8 h 后4℃和20℃試驗組TVB-N 含量分別為0.16和0.21 mg/g。在實際生產中，南極磷蝦原料應盡量避免高溫條件下長時間貯存。

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