產海藻糖合酶菌株的篩選及發酵條件的優化

段瑩瑩，趙　偉，曹大鵬，張曰輝，崔巍巍

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

產海藻糖合酶菌株的篩選及發酵條件的優化

段瑩瑩，趙偉，曹大鵬，張曰輝，崔巍巍

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

從土壤中分離篩選得到一株能合成海藻糖的菌株，經生物轉化途徑驗證，該菌株含有特異性地將麥芽糖轉化為海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖轉化率為評價指標，對其進行搖瓶發酵條件的優化。結果表明，其發酵最適條件為：碳源為2%麥芽糖，氮源為0.5%酵母粉和1%蛋白胨，發酵初始pH值為7.0，接種量4%，發酵溫度35℃，發酵時間48 h，在此優化條件下，海藻糖的轉化率為50%。

海藻糖，篩選，麥芽糖，發酵條件

海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩定性、抗凍結、干燥性等特性［1］，而且它對生物大分子和生物體組織有著非特異性的保護作用［2-3］。海藻糖作為一種添加劑、穩定劑和甜味劑已經廣泛應用于食品、化妝品和醫藥工業等領域［4］。但是，長久已來，海藻糖昂貴的價格一直制約著海藻糖在以上各個領域的廣泛應用。生產海藻糖的方法較多，有微生物抽提法、從發酵液中提取、酶轉化法和基因重組法［5-6］。酶法轉化海藻糖一直是工業生產海藻糖的主要途徑［7］，海藻糖合酶可通過轉糖基作用直接將麥芽糖轉化為海藻糖，在工業酶法生產海藻糖中最具優勢，而探究產海藻糖合酶菌株的發酵條件是降低海藻糖生產成本的一條有效途徑［8-12］。本研究從土壤中分離篩選得到一株能合成海藻糖的菌株，經生物轉化途徑驗證，該菌株含有特異性地將麥芽糖轉化為海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖轉化率為評價指標，對其進行搖瓶發酵條件的優化［13］。為海藻糖工業化生產提供了理論依據和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

土壤：取自山東福洋生物科技有限公司；菌株：從土壤中分離篩選。

1.1.2培養基

富集培養基：葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.5%，Mg2SO40.2%，鏈霉素0.003%，pH 6.5。

固體培養基：葡萄糖2%，酵母粉0.2%，Na2SO40.7%，CaCl20.7%，瓊脂2%，pH 7.0。

發酵培養基：麥芽糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，pH 7.0。

1.1.3試劑

海藻糖標準品、麥芽糖標準品、葡萄糖標準品：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酵母粉、蛋白胨：國藥集團化學試劑有限公司；硝酸銨、氯化銨、硫酸銨：天津市河東區紅巖試劑廠。

1.2儀器與設備

Waters515泵、Waters2414型示差折光檢測器、N2000雙通道色譜工作站的高效液相色譜儀：美國Waters公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器有限公司；FE-20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；3K15型冷凍離心機：美國Sigma公司；AH-BASIC型勻漿機：ATS工業系統有限公司；DHZ-DA型冷凍恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；SW-CJ-2D型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3方法

1.3.1產海藻糖菌株的初篩

取2g土樣，加入到100mL的富集培養基中，在35℃、220 r/min條件下進行富集培養，將富集后的菌液稀釋成10-1、10-2、……10-7，涂布于固體培養基平板，35℃培養48 h，挑取大小、形狀、顏色不一的具有典型特征的細菌單菌落，在固體培養基中進一步分離純化，反復3次后，挑取典型細菌單菌落于斜面上劃線，35℃培養48 h后于冰箱4℃保存，作為初篩斜面。

1.3.2產海藻糖合酶菌株驗證試驗

將初篩的菌株接種到發酵培養基上，35℃、220 r/min，搖床培養48 h，離心收集菌體，用pH 7.0的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液洗滌菌體2次后，加入與發酵液等體積的磷酸鈉緩沖液混勻，勻漿機低溫破碎菌體，獲得粗酶液。加入麥芽糖溶液，混合后使麥芽糖終含量為30%，50℃、120 r/min轉化反應12 h，煮沸10 min滅酶，離心收集上清液。

1.3.3產海藻糖菌株的鑒定

（1）菌落的形態特征

固體培養基35℃培養48 h后，菌落為圓形，乳白色，直徑約1.5 mm，周邊齊整，微凸，表面光滑，不透明，黏稠易挑起。

（2）菌株的生理生化特征

能利用葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、蔗糖、糊精產酸，但不產氣，不能利用乳糖和淀粉；能在低于10%NaCl的培養基中生長。

1.3.4分析檢測

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［14-15］測定海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的含量。色譜條件為：流動相：乙腈∶水=3∶1（V/V）；氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm）；檢測器：示差折光檢測器；柱溫：40℃；等度洗脫流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

海藻糖標準曲線的制備：用超純水分別配制質量濃度分別為0.6 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L、2.4 g/L、3.0 g/L海藻糖的標準溶液，HPLC分析后繪制標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數（R2）。

海藻糖轉化率的計算公式：

式中：C1為海藻糖的量，g；C2為麥芽糖的量，g。

1.3.5生物轉化途徑驗證

將產酶菌株所得粗酶液分為3份，每份20 mL，分別加入20 mL 60%的麥芽糖溶液、20 mL 60%的葡萄糖溶液、20mL去離子水，均于50℃、120r/min反應12h后煮沸10 min滅酶，將3份反應液離心后取上清液，采用高效液相色譜法測定反應液中海藻糖、麥芽糖、葡萄糖的含量。

1.3.6發酵培養基的優化

碳源的確定：制備種子液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL發酵培養基中，分別以2%麥芽糖、2%葡萄糖、2%蔗糖作為碳源，其他成分同1.1.2發酵培養基，35℃、220 r/min、搖瓶培養48 h后，收集菌體破碎，制備粗酶液進行酶解反應轉化，測定海藻糖轉化率。

氮源的確定：制備種子液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL發酵培養基中，分別以0.5%酵母粉+1%蛋白胨、1.5%硝酸銨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸銨作為氮源，其他成分同1.1.2發酵培養基，35℃、220 r/min搖床培養48 h后，菌體破碎，制備粗酶液進行酶解反應轉化，測定海藻糖轉化率。

1.3.7發酵工藝條件的優化

發酵溫度的確定：將產酶菌株按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優化后的發酵培養基中，分別于30℃、35℃、40℃、45℃，220 r/min、搖床培養48 h后，菌體破碎，制備粗酶液進行酶解反應轉化，測定海藻糖轉化率。

發酵pH的確定：將產酶菌株4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優化后的發酵培養基中，分別調節其初始pH 5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃，35℃、220 r/min搖床培養48 h后，收集菌體破碎，制備粗酶液進行酶解反應轉化，測定海藻糖轉化率。

接種量的確定：將產酶菌株按3%、4%、5%、6%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優化后的發酵培養基中，pH 7.0，35℃、220 r/min搖床培養48 h后，菌體破碎，制備粗酶液后進行轉化，測定海藻糖轉化率。

發酵時間的確定：將產酶菌株按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優化后的發酵培養基中，35℃、220 r/min搖床培養24 h、36 h、48 h、60 h后，菌體破碎，制備粗酶液后進行轉化，測定海藻糖轉化率。

2　結果與分析

2.1海藻糖標樣的測定及海藻糖標準曲線的建立

2.1.1海藻糖標樣的測定

應用高效液相色譜法測定海藻糖標樣，色譜圖見圖1。

圖1　海藻糖標樣HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of trehalose standard

2.1.2海藻糖標準曲線的建立

分別以海藻糖含量（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，利用高效液相色譜法測定海藻糖含量的標準曲線如圖2所示。

圖2　海藻糖的標準曲線Fig.2 Standard curve of trehalose

由圖2可知，海藻糖標準曲線的回歸方程為y=243 394x+ 20 883，相關系數R2=0.999 2，表明海藻糖含量和峰面積呈良好的線性關系。

2.2海藻糖樣品的測定

海藻糖粗酶液酶解反應轉化48 h，煮沸10 min滅酶后，將轉化液離心后取上清液，采用高效液相色譜法測定轉化液中海藻糖的轉化率，色譜圖見圖3。

圖3　轉化液HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of conversion solution

2.3菌株的篩選及產酶試驗

從固體培養基中共篩選出16株菌株，標記為Q1-Q16。對篩選出來的16株典型菌株進行產酶試驗，菌株代謝產海藻糖合酶試驗結果如表1。

2 生物標志物的類型 生物標志物的范圍非常廣泛，可以是為檢查器官功能或其他身體健康狀況而引入生物體的物質，如氯化銣用于同位素標記檢測心肌灌注情況；可以是用來表明特定疾病狀態的物質，如受到疾病感染時抗體的出現；也可以是特異性細胞、分子或基因、基因產物、酶或激素，復雜的器官功能，生物特性或生物結構等。

表1　產海藻糖合酶菌株的選育Table 1 Screening of trehalose synthase producing strains

由表1可知，16株菌株中，有10株可定量檢測到能利用麥芽糖生成海藻糖，其他6株檢測不到，可能是菌株產的酶活力不好，生成的海藻糖很少，在這10株中，Q12的海藻糖轉化率明顯高于其他菌株，故作為本試驗的目的菌株。

2.4生物轉化海藻糖的途徑

利用海藻糖合酶不作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽寡糖、蔗糖、異麥芽糖、異麥芽寡糖等這一特點，以葡萄糖、麥芽糖、去離子水為不同的底物，通過對反應產物的定性定量分析對海藻糖的合成途徑進行初步驗證，測定結果見表2。

表2　不同底物反應體系的高效液相色譜法分析結果Table 2 HPLC analysis results of different substrate reaction system

由表2可知，底物為30%麥芽糖時，一部分的麥芽糖被轉化生成了海藻糖，底物為30%葡萄糖時，并未檢測到海藻糖的存在，通過3個體系的分析結果可知，此菌株在以麥芽糖為底物合成海藻糖的途徑是通過海藻糖合酶完成的。

2.5菌株Q12發酵條件的研究

2.5.1碳源對海藻糖轉化率的影響

圖4　不同碳源對海藻糖轉化率的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the conversion rate of trehalose

由圖4可知，以2%麥芽糖為碳源時海藻糖轉化率最高，為49.3%，這可能是由于酶的作用底物或底物類似物能誘導發酵產酶的原因，所以選擇最適宜菌株產酶的碳源為2%麥芽糖。

2.5.2氮源對海藻糖轉化率的影響

由圖5可知，以0.5%酵母粉+1%蛋白胨為氮源時海藻糖轉化率最高，為45.8%，這可能是有機氮源含有豐富的營養物質和蛋白質、肽類、游離的氨基酸以及少量的生長因子等可供微生物直接利用，有利于菌體生長產酶，所以菌株產酶的最適氮源為0.5%酵母粉+1%蛋白胨。

圖5　不同氮源對海藻糖轉化率的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the conversion rate of trehalose

2.5.3發酵溫度對海藻糖轉化率的影響

圖6　發酵溫度對海藻糖轉化率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the conversion rate of trehalose

由圖6可知，當發酵溫度為35℃時海藻糖轉化率最高，為47.1%，過高或過低的溫度都不利于菌體生長和海藻糖的積累，最佳發酵溫度為35℃。

2.5.4發酵初始pH對海藻糖轉化率的影響

圖7　發酵初始pH對海藻糖轉化率的影響Fig.7 Effect of the initial pH on the conversion rate of trehalose

由圖7可知，最佳發酵的初始pH為7.0，海藻糖轉化率最高，為49.8%。較低的pH抑制菌株的生長，較高的pH有利于菌的生長而不利于海藻糖的積累。

2.5.5接種量對海藻糖轉化率的影響

圖8　接種量對海藻糖轉化率的影響Fig.8 Effect of inoculum on the conversion rate of trehalose

由圖8可知，最佳接種量為4%，海藻糖轉化率最高，為48.2%。接種量＜4%時，發酵前期生長緩慢，延長發酵周期，接種量＞4%時，菌株較快達到了穩定期，自溶也快。

2.5.6發酵時間對海藻糖轉化率的影響

圖9　發酵時間對海藻糖轉化率的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the conversion rate of trehalose

由圖9可知，發酵48 h時海藻糖轉化率最高，為47.9%，隨著發酵時間的延長，海藻糖轉化率稍有下降，延長發酵時間并不能增加海藻糖的積累。因此，最佳發酵時間為48 h。

3　結論

通過篩選得到一株菌株Q12，其海藻糖轉化率最高，并且確定了該菌株是以麥芽糖為底物通過海藻糖合酶途徑合成海藻糖的。菌株Q12的最適發酵條件為：碳源為2%麥芽糖，氮源為0.5%酵母粉和1%蛋白胨，發酵初始pH值為7.0，接種量4%，發酵溫度35℃，發酵時間48 h，在此優化條件下，海藻糖的含量為15.1%，海藻糖的轉化率49.8%。

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Screening of trehalose synthase producing strain and optimization of its fermentation conditions

DUAN Yingying，ZHAO Wei，CAO Dapeng，ZHANG Yuehui，CUI Weiwei
（Shangdong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

A trehalose synthase producing strain was isolated and screened from soil.Through biological transformation pathway identification，the strain contained trehalose synthase could convert maltose into trehalose.Using the conversion rate of trehalose as evaluation index，flask-shaking fermentation conditions were optimized.The results showed that the optimal fermentation conditions were maltose 2%as carbon source，yeast extract 0.5%and peptone 1%as nitrogen source，initial pH 7.0，inoculum 4%，fermentation temperature 35℃，fermentation time 48 h.Under this condition，the conversion rate of trehalose was 50%.

trehalose；screen；maltose；fermentation conditions

Q939.97

A

0254-5071（2015）10-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.012

2015-09-06

段瑩瑩（1985-），女，工程師，碩士，研究方向為微生物發酵。