醬香大曲中高產蛋白酶功能細菌的篩選及鑒定

王　婧，王曉丹，3，羅曉葉，邱樹毅，肖　蓓，張小龍，胡鵬剛*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

醬香大曲中高產蛋白酶功能細菌的篩選及鑒定

王婧1，2，王曉丹1，2，3，羅曉葉1，2，邱樹毅1，2，肖蓓1，2，張小龍1，3，胡鵬剛1，2*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

通過對醬香型大曲中的細菌進行分離純化培養，獲得一株高產蛋白酶的菌株FBKL1.0199，然后采用菌株形態學觀察、生理生化實驗和分子生物學方法，鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。實驗條件下該菌株所產中性蛋白酶高達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力達139.27 U/g，為提高醬香型白酒品質研究奠定了基礎。

醬香大曲；高產蛋白酶；發酵工藝；地衣芽胞桿菌

醬香型白酒具有獨特的生產工藝，綜合概括其特點為“四高三長，一大一多”，其中高溫制曲就是“四高”之一，高溫醬香型大曲是醬香的原動力及來源。醬香型大曲的制曲溫度高達65℃，在高溫低濕的環境下，形成了特殊的微生物體系，這些微生物的代謝產物對醬香型白酒的風格具有重要貢獻［1-2］。

醬香型大曲的制曲過程中，在其特定的工藝條件下，微生物通過自身的生長代謝可產生豐富的酶系，其中就包含了對白酒生產至關重要的蛋白酶和淀粉酶，蛋白酶可將原料中的粗蛋白降解成各種氨基酸，使得大曲中富含的氨基酸種類和數量增多。同時，淀粉酶將原料中的淀粉降解成糖，氨基酸和糖在其特殊的環境中發生美拉德反應，生成具有醬香風味的物質。其次，氨基酸加熱分解時也會產生醬香味物質［3］。大曲不僅為釀造提供了糖化發酵劑，還為發酵提供了前體物質［4］。

蛋白酶在白酒的釀造過程中，可以有溶解發酵原料的顆粒、促進微生物繁殖以及分解蛋白質生成香味物質、降解酵母菌體蛋白等多種功能，高活力的蛋白酶可以提高白酒的產量和質量［5］。本研究從醬香大曲中通過模擬醬香大曲發酵工藝，采用福林酚法測蛋白酶活力，分離篩選出高產蛋白酶的細菌，有助于醬香大曲中高產蛋白酶微生物的研究，對生產出優良的醬香大曲具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬香大曲：貴州珍酒釀酒有限公司提供；酪氨酸：上海長江生物制藥廠；干酪素、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀：天津市海光化學試劑廠；福林-酚：北京索萊寶生物科技有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、乙酸鈉：重慶北碚精細化工廠；磷酸氫二鉀：成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

分離培養基采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，營養瓊脂15～20 g加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

液體培養基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養基：干酪素10.0 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

固體培養基：麩皮20g，蒸餾水20mL，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

JJ-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；THZ-92B臺式恒溫振蕩器：上海浦東物理光學儀器廠；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器、BMJ-250C微生物培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備；FA1004電子天平：上海箐海儀器有限公司；BM1000生物顯微鏡：河南兄弟儀器設備有限公司；GT10-1型離心機：北京時代北利離心機有限公司；PTC-100 PCR儀器：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1功能細菌的分離、純化

在無菌條件下稱取成品樣品大曲10 g，加入已滅菌的生理鹽水90 mL，混勻制備成菌懸液。再從中取菌懸液1mL加入無菌生理鹽水，以10倍為稀釋單位，逐次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，從不同稀釋倍數的菌懸液中取0.2 mL涂布接種于平皿上，其中10-4和10-7倍各做3個平行，10-5和10-6倍各做5個平行，35℃倒置培養1 d［6］。將平皿上長勢良好且菌落形態上有較大差異的細菌采用平板劃線法將其純化，然后接入固體斜面培養基上，4℃保存備用。

1.3.2產蛋白酶細菌初篩

將以上分離得到的菌株做透明圈實驗，以透明圈作為考察指標進行初篩。從固體斜面培養基上將細菌轉接至牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上活化，然后將這些菌株以點接法接種到酪蛋白瓊脂培養基上，35℃倒置培養1 d后觀察透明圈大小，并用直尺測量透明圈直徑D（mm）和菌落直徑d（mm）的比值（D/d），選出能產生較大透明圈的菌株。

1.3.3產蛋白酶細菌復篩

模擬生產發酵工藝，將篩選出的能產生較大透明圈的菌株進行復篩，做菌種產蛋白酶性能試驗。先將菌株接到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，35℃倒置培養24 h后，然后從平板上的單菌落挑取一環移至液體培養基中，35℃搖床培養24 h制備成菌懸液。以10%的接種量將菌懸液加到固體培養基中。按照35℃、45℃、55℃24 h梯度升溫靜置培養3 d［7］。稱取10 g固態發酵產物于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，40℃水浴鍋中水浴1 h，其中每隔15 min攪拌一次，經濾紙過濾后獲得粗酶液。分別配制pH 3.0的乙酸乙酸鈉緩沖液和pH 7.2的磷酸緩沖液，測定其酸性和中性蛋白酶。

1.3.4蛋白酶活力測定

采用福林-酚法測蛋白酶活力，具體操作步驟參見商業行業標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，繪制酪氨酸標準曲線。蛋白酶活力定義：在40℃條件下，每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活性單位（U/g）。蛋白酶活力計算公式如下：

式中：A為由樣品測得OD值，查標準曲線得相當的酪氨酸微克數，μg；4為4 mL反應液取出1 mL測定；N為酶液稀釋的倍數；10為反應時間，min；W為樣品水分百分含量，%。

1.3.5高產蛋白酶菌株的鑒定

（1）菌株形態學觀察

將高產蛋白酶的細菌在平板上活化，再以點接法接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，觀察其單菌落形態。革蘭氏染色顯微鏡觀察其菌體形態。

（2）生理生化試驗

按《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）［8］及《一般細菌常用鑒定方法》［9］對細菌進行生理生化試驗。

（3）分子生物學鑒定

根據細菌DNA提取試劑盒說明書，采用細菌16S rDNA通用PCR引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行擴增［13］，在25.0 μL PCR反應體系中，加上、下游引物1492r和27f各1.0 μL，Mix 12.5 μL，細菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增條件為初始變性94℃、5 min，然后變性94℃、0.5 min，退火55℃、0.5 min，復性72℃、1.5 min，30個循環，最后延伸72℃、10 min。取2 μL DNA溶液于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳40 min左右。

測序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rDNA測序方法對菌株進行分子鑒定。所得測序結果輸入美國國家生物信息技術中心（National Center of Biotechnology Information NCBI）數據庫中進行BLAST比對，用Neighbor-Joining構建目標菌的系統發育樹。

2　結果與分析

2.1功能細菌的分離

通過平板稀釋涂布法，從醬香大曲中分離得到18株菌落形態上有較大差異的細菌。

2.2功能細菌的篩選

2.2.1產蛋白酶細菌初篩

觀察由點接法接種的酪蛋白瓊脂培養基，不同菌種在培養基上出現了大小不一的透明圈，其中有7株透明圈較大，測得其HC值，結果如表1所示。

表1　透明圈HC值Table 1 HC value of the transparent circle

由表1可知，FBKL1.0199菌株透明圈與菌落直徑比值最大，說明其對培養基中干酪素的分解利用能力較強，即產生蛋白酶的活力較高。對以上菌株進行復篩，以準確測定其所產蛋白酶活力。

2.2.2產蛋白酶細菌復篩

以吸光度值（y）為縱坐標，酪氨酸質量濃度（x）為橫坐標，繪制酪氨酸標準曲線如圖1所示。

圖1　酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

由圖1可知，酪氨酸標準曲線回歸方程為y=0.009 2x+ 0.006 4，相關系數R為0.996 6，表明二者線性關系良好。

將初篩得到的7株細菌制備成菌懸液，以10%的接種量加入到固體培養基中，模擬大曲生產發酵工藝，培養3 d后取其發酵產物用福林-酚法測定其中性和酸性蛋白酶。其結果分別如表2和表3所示。

由表2和表3可以看出，產中性蛋白酶最高的是FBKL 1.0199，其蛋白酶活力高達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相對較高，達139.27 U/g。產酸性蛋白酶最高的是FBKL 1.0191，蛋白酶活力為189.07 U/g，但其中性蛋白酶酶活較低，僅為90.94 U/g。綜合以上結果，FBKL 1.0199菌株具有高產蛋白酶的特性，選擇FBKL 1.0199進行種屬鑒定。

表2　中性蛋白酶活力測定結果Table 2 Determination results of neutral protease activities

表3　酸性蛋白活力測定結果Table 3 Determination results of acid protease activities

2.2.3高產蛋白酶菌株鑒定

（1）菌株形態學觀察

對篩選出的FBKL1.0199以點接法接種進行培養，觀察其菌落形態及細胞形態，結果如圖2所示。由圖2可知，FBKL1.0199菌株菌落顏色為灰白色，中間有微黃小環，菌落呈圓形，微微凸起，邊緣為鞭毛狀，干燥無光澤。革蘭氏染色菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌，細胞形態為桿狀。

圖2　FBKL1.0199的菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.2 Colony morphology（A）and cell morphology（B）of strain FBKL1.0199

（2）生理生化試驗

高產蛋白酶菌株FBKL1.0199生理生化試驗結果見表4。

由表4可知，FBKL1.0199菌株其生理生化實驗結果表明，其接觸酶呈陽性，能利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖產酸，可利用檸檬酸鹽，兼性厭氧。參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，初步認定FBKL1.0199菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），利用分子生物學手段對其進行進一步的鑒定。

表4　FBKL1.0199生理生化試驗結果Table 4 Physiological and biochemical tests results of strain FBKL1.0199

（3）分子生物學鑒定

采用16S rDNA測序方法對FBKL1.0199菌株進行分子鑒定，對DNA進行序列擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。由圖3可知，PCR擴增片段長度約為1 500 bp左右。將所得測序結果輸入NCBI中進行BLAST比對，用Neighbor-Joining法構建目標菌的系統發育樹，結果見圖4，根據比對結果FBKL1.0199與地衣芽孢桿菌相似性達到99%，結合菌落形態及生理生化實驗，將其鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖3　FBKL1.0199PCR擴增產物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern of PCR amplification products of strain FBKL1.0199

圖4　FBKL1.0199系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain FBKL1.0199

3　結論

采用平板稀釋涂布法分離純化，篩選獲得了一株高產蛋白酶的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199，模擬醬香型大曲生產發酵工藝，通過梯度升溫發酵，其所產的中性蛋白酶活力高達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力達139.27 U/g。同時，其固態發酵產物具有明顯的醬香氣味，這說明了其對于醬香型酒風格的形成具有重大作用。

綜上所述，篩選得到的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199對醬香型白酒的生產有重要意義，進一步研究FBKL1.0199固態發酵時的代謝情況，探究其代謝產物與醬香風味成分的關系，為生產提供了理論基礎依據。

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Screening and identification of functional bacteria with high-yield protease from Moutai-flavor Daqu

WANG Jing1，2，WANG Xiaodan1，2，3，LUO Xiaoye1，2，QIU Shuyi1，2，XIAO Bei1，2，ZHANG Xiaolong1，3，HU Penggang1，2*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.School of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Through separation and purification of bacteria from Moutai-flavor Daqu，strain FBKL1.0199 with high-yield protease was acquired，and after morphology observation，physiological and biochemical experiment，and molecular biology identification，the strain was identified asBacillus licheniformis.Under the experimental conditions，the neutral protease was as high as 3 925.80 U/g，and the acid protease activity reached 139.27 U/g，which laid a foundation for improving the quality of Moutai-flavor liquor.

Moutai-flavor Daqu；high-yield protease；fermentation process；Bacillus licheniformis

TS261.1

A

0254-5071（2015）10-0043-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.010

2015-09-16

貴州省科技廳重點攻關項目（黔科合GZ字［2014］3012）；貴州省科技廳重大專項項目（黔科合重大專項字［2013］6009號）；科技部科技支撐計劃項目課題（2011BAC06B12）；貴州省科技廳聯合資金項目（黔科合LH字［2014］7672）

王婧（1991-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

胡鵬剛（1964-），男，教授，本科，研究方向為發酵工程和現代分離技術。