耐受乙醇乳酸菌誘變的研究

王曉雯，蔣彩虹，盧士玲，蘆文娟，杜紫萱，黎　旭，李寶坤*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

耐受乙醇乳酸菌誘變的研究

王曉雯，蔣彩虹，盧士玲，蘆文娟，杜紫萱，黎旭，李寶坤*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）為研究對象，分別選取不同濃度乙醇脅迫處理后，進行誘變育種，探究經乙醇脅迫后乳酸菌誘變育種的耐受性；根據最佳誘變劑量的條件，確定最佳誘變方法；以乙醇脅迫處理后乳酸桿菌的生長曲線，驗證乙醇脅迫后乳酸菌誘變菌株的耐受性。結果表明：添加與乳酸菌懸浮液等體積的1%硫酸二乙酯（DES）化學誘變效果最佳，最適誘變時間為40 min，乙醇脅迫過程中誘變菌株的生長速率有所提高，以體積分數8%乙醇脅迫為例，24 h時，D2-5菌落總數的對數值由6.2提高至7.3，D5-5菌落總數的對數值由6.9提高至7.1。說明誘變育種有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，并獲得乙醇耐受特性較好的菌株D2-5。

乳酸菌；乙醇脅迫；誘變育種；耐受性

乳酸菌是革蘭氏染色陽性的桿菌或球菌，對葡萄糖發酵能產生50%以上乳酸的一類微生物的總稱［1］。這些微生物類群有著一些共同的特征，如不產孢子、厭氧或兼性厭氧、接觸酶為陰性、沒有細胞色素、革蘭氏陽性桿菌或球菌等。人類自古就利用乳酸菌來保存食物，提高食品的風味和改善食品的品質［2］。由于這些細菌可以耐受較低的pH值，直到19世紀中葉，才在食品微生物發酵的過程中被發現［3］。許多乳酸菌被公認為安全的食品成分［4］。優良乳酸菌應該具有良好的發酵性能和較強的耐受性，從而確保發酵制品被食用后能在胃腸道中定植，這是益生乳酸菌發揮作用的關鍵［5］。

由于外界各種不良環境的脅迫及不利因素的影響，嚴重地限制了乳酸桿菌的生長及代謝能力，進而影響了益生功能的發揮，抑制了高效活性的利用［6］。發酵制品通常都由乳酸菌與酵母菌共同發酵而成［7］，其發酵過程中所產生的代謝產物，造成生存環境不斷改變，菌體不可避免的受到各種脅迫條件的影響，如溫度、pH值、乙醇、滲透壓等，其中乙醇是最常見的脅迫因子之一［8］。乙醇濃度過高就會影響菌體的新陳代謝、生理活性等［9］。利用物理或化學誘變劑對均勻分散的微生物細胞群進行處理的育種方式被稱為誘變育種，它可以促進菌株的遺傳特性產生突變，突變頻率比其自發突變高出幾百甚至上千倍，突變幾率一般在10-6～10-9范圍內［10］。當前發酵工業和其他微生物生產部門所使用的高產菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種來明顯提高其生產性能，且具有變異范圍廣泛、類型多樣等優秀特點，所以仍是目前廣泛使用的一種育種手段［11］。

本試驗以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）為研究對象，分別選取不同濃度乙醇脅迫處理后，進行誘變育種，探究經乙醇脅迫后乳酸菌誘變育種的耐受性；根據最佳誘變劑量的條件，確定最佳誘變方法，以期獲得耐受特性較好的菌株，為乳酸菌選育技術的應用提供了理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）均來自石河子大學食品學院實驗室。

1.1.2培養基及其制備

MRS液體培養基［12］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 6.2～6.4，115℃滅菌20 min。

MRS固體培養基：MRS液體培養基中加瓊脂粉20 g，調pH 6.2～6.4，115℃滅菌20 min。

1.1.3化學試劑

硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、無水乙醇：天津市致遠化學試劑有限公司；氯化鈉：天津市永晟精細化工有限公司；硫代硫酸鈉（Na2S2O3）：天津市盛奧化學試劑有限公司；所有試驗試劑均為分析純。

1.2儀器及設備

Neofuge型高速冷凍離心機：力康發展（香港）有限公司；SW-CJ型無菌操作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-40型滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；HI8424NEW型酸度計：北京哈納科儀科技有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；BS2000S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1細胞懸浮液制備

將二次活化的菌種分別接種于含體積分數分別為0、5%、6%和8%乙醇的MRS液體培養基中培養，培養至對數生長末期，4℃離心（4 000 r/min、5 min）收集沉淀得菌體。用0.85%無菌生理鹽水將菌體洗滌2次，配制成乳酸菌懸浮液，備用［13］。

1.3.2誘變

（1）紫外（ultra violet，UV）誘變

將配制好的乳酸菌懸浮液以10倍稀釋法稀釋得到10-5、10-6、10-7三個梯度。分別從這三個梯度中吸取菌液置于MRS固體培養基平板上，打開平板蓋，用紫外燈照射0.5～3.5 min（按每1 min遞增），照射后立即蓋上平板蓋，均勻涂布后用黑色塑料袋包好，每個稀釋度涂布2個平板，于37℃恒溫培養24 h［14］。致死率計算公式如下：

以紫外照射時間為橫坐標，乳酸菌的致死率為縱坐標，繪制乳酸菌的致死率曲線。

（2）DES誘變

將配制好的乳酸菌懸浮液，加入等體積1%硫酸二乙酯，37℃水浴振蕩鍋中誘變培養10～50 min（按每10 min遞增），加入l mL 2%Na2S2O3終止反應。各取誘變后的菌液涂布MRS固體培養基上，37℃培養24 h。計算不同誘變時間的致死率，以誘變時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制兩種乳酸菌的致死率曲線［14］。

（3）復合誘變

仍然用原始出發菌株，先用紫外誘變得到的最佳誘變劑量（方法同上），篩選得到兩種優良突變株，挑取優良突變株，在MRS固體培養基上劃線，37℃培養24 h，挑取單菌落，配制成乳酸菌懸浮液，加入等體積1%硫酸二乙酯，37℃水浴振蕩鍋中誘變培養10～50 min（按每10 min遞增），加入l mL 2%Na2S2O3終止反應。各取誘變后的菌液涂布MRS固體培養基上，37℃培養24 h，計算不同誘變時間的致死率。

1.3.3乙醇脅迫乳酸桿菌生長曲線的測定

研究表明，一般體積分數5%的乙醇溶液就可抑制菌體的生長速率［15］，秦偉帥等［16］研究發現乙醇濃度過高就會影響菌體的新陳代謝、生理活性等。DA SILVEIRA M G等［17］研究認為，在乙醇體積分數為8%～10%的條件下，細菌的生長會受到明顯抑制，體積分數為12.5%以上的乙醇不僅抑制細菌的生長，甚至會造成菌體的大量死亡［18］。因此選擇體積分數分別為0、5%、8%的乙醇測定其生長曲線。將活化后的種子液接入含0、5%、8%的乙醇的MRS培養基中，靜置培養至對數末期每隔2 h取樣進行平板計數，分別做3個平行，以培養時間為橫坐標，菌落總數為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

2　結果與分析

2.1不同紫外照射時間對致死率的影響

由圖1可知，兩株菌種致死率變化規律基本一致，隨著紫外照射時間的延長，菌株的致死率逐漸上升；紫外照射時間為0.5 min時菌種致死率達到50%以上；當照射1.5 min時兩菌株致死率達到70%以上；當照射2.5 min時兩菌種致死率均達到80%～90%，當照射3.5min時致死率接近100%。

據文獻報道［19］，近年來一般認為，誘變后菌株的致死率在80%～90%時誘變效果較好，更容易篩選到變異幅度大的突變菌株，以下試驗均以此為依據確定最佳誘變劑量。

因此，選擇紫外線照射2.5 min為菌株D2-5和D5-5的紫外誘變的劑量最佳照射時間。

圖1　不同紫外線（UV）照射時間對致死率的影響Fig.1 Effect of different irradiated time by UV mutation on fatality rate

2.2不同DES化學誘變時間對致死率的影響

由圖2可知，接入乙醇體積分數越高，致死率相對較高。隨著DES化學誘變時間的延長，乳酸菌的致死率增加；當DES化學誘變時間為20min時，兩菌株致死率均基本達到60%以上；當誘變時間為40min時兩株菌致死率達到80%～90%，當誘變時間為50 min時致死率接近100%。

圖2　不同DES化學誘變時間對乳酸菌致死率的影響Fig.2 Effect of chemical mutagenesis time by DES mutation on fatality rate

結果表明，兩菌株在不同乙醇體積分數下硫酸二乙酯化學誘變的致死率在誘變時間為40 min時都達到了80%～90%，故硫酸二乙酯化學誘變40 min的效果最佳。

2.3復合誘變試驗結果

由表1可知，復合誘變的誘變條件為紫外照射2.5 min+硫酸二乙酯誘變20 min時兩株菌致死率達到80%～90%，故在此條件下復合誘變的效果最佳。

表1　接種不同體積分數乙醇的復合誘變對致死率的影響Table 1 Effect of compound mutation with different ethanol concentration on fatality rate%

2.4不同乙醇體積分數對乳酸菌誘變pH值的變化

不同體積分數乙醇對菌株D2-5和D5-5不同誘變過程中的pH值變化，結果見圖3。

圖3　不同體積分數乙醇條件下對菌株D2-5（A）及D5-5（B）誘變pH值的變化曲線Fig.3 The curve of pH for strains D2-5（A）and D5-5（B）by different mutation under different ethanol concentration

由圖3可知，原菌、紫外誘變、硫酸二乙酯化學誘變和復合誘變過程中乙醇脅迫濃度越大，pH值越高，菌株酸性越弱；通過不同的誘變處理，菌種D2-5和D5-5的pH變化趨勢基本一致，在硫酸二乙酯化學誘變過程中pH達到最低，分別為3.15和3.11；由于pH值越低產酸能力越強，所以硫酸二乙酯化學誘變的效果最佳。

2.5乙醇脅迫處理乳酸桿菌的生長曲線

硫酸二乙酯化學誘變，誘變時間40 min，在此條件下測定乙醇脅迫處理后乳酸桿菌的生長曲線，結果見圖4。

圖4　不同乙醇濃度脅迫后原始菌株與DES化學誘變菌株的生長曲線Fig.4 The growth curve of the original and DES mutation strains after different ethanol concentrations stress

相對于原始菌株來說，乙醇脅迫過程中誘變菌株的生長速率有所提高，隨著乙醇體積分數的逐步增加，生長速率有所下降。以未經乙醇脅迫處理的菌體為對照，經過體積分數5%乙醇脅迫處理的誘變菌株生長曲線與對照菌株部分重合，而體積分數8%乙醇脅迫菌體生長速率有所提高。在經體積分數8%乙醇脅迫24 h時，D2-5原始菌株菌落總數的對數值為6.2，誘變菌株菌落總數的對數值為7.3，D5-5原始菌株菌落總數的對數值為6.9，誘變菌株菌落總數的對數值為7.1，這一結果說明誘變有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，且D2-5比D5-5效果顯著。不同菌體同一乙醇濃度脅迫耐受性不同，D5-5原始菌株生長速率高于D2-5，雖然D5-5誘變菌株在受到體積分數8%乙醇脅迫初期生長速率明顯高于D2-5，呈上升趨勢，但24 h后兩菌菌落總數的對數值基本相同，分別為7.1和7.3；同一菌體不同乙醇濃度脅迫耐受性也有所不同，兩株菌不同時間受體積分數為5%乙醇脅迫生長速率較高。

3　結論

本研究以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Latobacillus plantarumD5-5）為研究對象，經乙醇脅迫處理后進行誘變育種，探究乳酸菌誘變育種乙醇耐受菌株，確定最佳誘變方法。結果表明，硫酸二乙酯化學誘變的效果最佳，且兩株菌誘變后產酸能力相差不大。乙醇脅迫過程中誘變菌株的生長速率有所提高，隨著乙醇體積分數的逐步增加，生長速率有所下降，在經體積分數8%乙醇脅迫24 h時，D2-5原始菌株菌落總數的對數值為6.2，誘變菌株菌落總數的對數值為7.3，D5-5原始菌株菌落總數的對數值為6.9，誘變菌株菌落總數的對數值為7.1，說明誘變育種有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，且D2-5比D5-5效果顯著，因此獲得乙醇耐受特性較好的菌株D2-5，本研究結果擴大了能夠耐受乙醇的微生物資源，為利用高耐受菌株提高乙醇產量奠定基礎。

［1］烏日娜，岳喜慶，張和平.干酪乳桿菌對數生長期與穩定期蛋白質組比較分析［J］.自然科學，2012，33（13）：148-151.

［2］SHORTT C.The probiotic century:historical and current perspectives［J］. Trends Food Sci Tech，1999，10（12）:411-417.

［3］何亮，熊禮寬，曾忠銘.乳桿菌的分類與分子鑒定方法研究進展［J］.中國微生態學雜志，2007，19（3）：312-313.

［4］LIONG M T.Safety of probiotics:translocation and infection［J］.Nutr Rev，2008，66（4）:192-202.

［5］任大勇，李昌.乳酸菌益生功能及作用機制研究進展［J］.中國獸藥雜志，2011（2）：47-50.

［6］吳重德.干酪乳桿菌抵御酸脅迫的生理機制解析［D］.無錫：江南大學博士論文，2012.

［7］閆彬.酸馬奶中乳酸菌與酵母菌的共生發酵性［J］.食品科學，2012，33（7）：131-137.

［8］張敏，毛健，黃桂東，等.清酒釀酒酵母酒精耐受機理的研究進展［J］.食品工業科技，2012，33（20）：342-350.

［9］李愛霞，王盼雪，樊明濤，等.植物乳桿菌對pH、酒精濃度和SO2濃度耐受性的研究［J］.中國釀造，2013，32（9）：42-46.

［10］朱曜.微生物誘變育種中的幾個問題［J］.四川食品與發酵，1993，20（4）：5-8.

［11］車黎猛，任發政，陳尚武.抗后酸化保加利亞乳桿菌的紫外誘變選育［J］.食品科學，2006，27（6）：109-112.

［12］閔華.發酵蔬菜乳酸菌的分離及培養基的篩選［J］.江西農業學報，2002，14（2）：62-64.

［13］施巧琴，吳松剛.工業微生物育種學［M］.科學出版社，2003.

［14］劉嫻.凝固型蜂蜜一脫脂乳酸奶高還原糖轉化率乳酸菌的誘變育種［D］.合肥：合肥工業大學碩士論文，2007.

［15］屈慧鴿，程顯好，鄧軍哲，等.葡萄酒生境對乳酸菌代謝的影響［J］.微生物學通報，2008，35（11）：1797-1801.

［16］秦偉帥，王玉峰，趙新節，等.葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵工藝控制研究進展［J］.中外葡萄與葡萄酒，2008（5）：64-67.

［17］DA SILVEIRA M G，ABEE T.Activity of ethanol-stressedOenococcus oenicells:a flow cytometric approach［J］.J Appl Microbiol，2009，106（5）:1690-1696.

［18］趙文英，李華，王愛蓮，等.不同培養基對酒酒球菌SD-2a存活率及膜脂肪酸組分的影響［J］.微生物學報，2008（10）：1319-1323.

［19］諸葛健.工業微生物實驗技術手冊［M］.北京：中國輕工出版社，1994.

Research on mutagenesis of ethanol tolerance lactic acid bacteria

WANG Xiaowen，JIANG Caihong，LU Shiling，LU Wenjuan，DU Zixuan，LI Xu，LI Baokun*
（Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

UsingLactobacillus crustorumD2-5 andLactobacillus plantarumD5-5 as the research object，they were selected by mutation after different concentrations of ethanol stress processing.The tolerance of lactic acid bacteria mutation breeding after ethanol stress processing was investigated. According to the optimum mutation dose，the optimum mutation method was determined.The tolerance of lactic acid bacteria mutant strain was verified by growth curve of lactic acid bacteria after different ethanol concentrations stress processing.The results shown that the optimum chemical mutagenesis was 1%diethyl sulfate added equal volume with lactic acid bacteria suspensions，the optimal mutagenesis time was 40 min，the growth rate of mutant strain was increased during ethanol stress processing.Taking 8%ethanol for an example，the Log value of strain D2-5 total bacterial count increased from 6.2 to 7.3，the value of strain D5-5 increased from 6.9 to 7.1 after 24 h.The study indicated that mutation breeding could improve the ethanol stress tolerance of lactic acid bacteria，and the strain D2-5 with high ethanol tolerance was obtained.

Lactobacillus；ethanol stress；mutagenesis breeding；tolerance

TQ923

A

0254-5071（2015）10-0032-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.008

2015-09-17

國家自然基金地區項目（31560444）；國家自然基金青年項目（31201395）；兵團博士基金專項（2014BB005）；石河子大學重大科技攻關項目（gxjs2014-zdgg07）；石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX201223）；國家自然基金地區項目（31460007）；國家自然基金青年項目（31301523）

王曉雯（1992-），女，碩士研究生，研究方向為畜產品加工與安全。

李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量安全。