引入中性氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩定性的影響

陳亞文，周晨妍*，謝晶晶，索婧琪，魏陽陽，李同彪

（新鄉醫學院生命科學技術學院，河南新鄉453003）

引入中性氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩定性的影響

陳亞文，周晨妍*，謝晶晶，索婧琪，魏陽陽，李同彪

（新鄉醫學院生命科學技術學院，河南新鄉453003）

通過對黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2進行生物信息學分析，在N-端區域引入半胱氨酸，定點突變E27C，構建突變基因xyn-E27C，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達。酶學性質分析發現，突變酶Xyn-E27C的最適溫度為45℃，與原酶XynZF-2相比提高了5℃。在40℃條件下，突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/240℃為100 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=55 min）提高了45 min。在45℃條件下，突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃為24 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=7 min）提高了17 min；突變酶Xyn-E27C的最適pH值由5.0提高至5.5，而pH穩定范圍均為5.0～9.0。因此，定點突變E27C對木聚糖酶XynZF-2的熱穩定性以及最適pH值均有重要影響。

木聚糖酶；熱穩定性；定點突變；中性氨基酸

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是催化水解木聚糖β-1，4糖苷鍵的一類多功能酶總稱［1］，產物主要是低聚木糖，有時還有少許的阿拉伯糖、木糖等成分［2］。木聚糖酶是木聚糖降解酶中最關鍵的酶［3］，其廣泛分布于各種生物體中，如海洋藻類、細菌、真菌、酵母、甲殼動物、陸地植物以及各種無脊椎動物［4］等，目前研究的木聚糖酶主要來源于微生物［5］。

在工業應用方面，木聚糖酶具有很大的潛力和價值，它是一種重要的酶制劑，廣泛應用于食品加工、紙漿漂白、制藥、飼料添加劑、醫藥、紡織、生物轉化等行業［6］。一般來說，在工業應用上的酶都需要高催化活性、耐高溫等性質。如在紙漿漂白工藝中添加木聚糖酶，可以增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂白用化學物質用量，減少造紙業對環境的污染等［7］。而工業上紙漿漂白需要60℃左右處理過程，自然界中的木聚糖酶大多屬于中溫木聚糖酶，難以達到其工業需求［8］。因此，對于木聚糖酶的熱穩定性改造已成為廣泛關注的熱點［9］。研究表明，很多因素可以影響木聚糖酶的熱穩定性（如二硫鍵、氫鍵、疏水作用、離子鍵等［10］）。GH11家族木聚糖酶具有分子質量小、底物特異性高、空間結構為右手半握形狀、結構比較簡單等特點［11］。N端區域是影響GH11家族的熱穩定性的重要因素，如DUMAN C等［12］對GH11家族木聚糖酶（EvXyn11TS）N端的7個氨基酸進行定點突變（T13F、S9P、N14H、Y18F、Q34L、S35E和S71T），突變酶比野生酶的Tm值提高了約25℃。LEEY E等［13］將木聚糖酶XynA的N-端刪除，發現突變酶熱穩定性喪失但活性不變，可確定木聚糖酶的N-端是其熱穩定性區。

來源于黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S的木聚糖酶XynZF-2屬于GH11家族中溫木聚糖酶，木聚糖酶基因xynZF-2已由本實驗室分離，并構建在pET-28a-xynZF-2保存［14］。該研究在對xynZF-2基因進行生物信息學分析的基礎上，選擇N-端的第27位點氨基酸進行定點突變（E27C），在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，期望提高木聚糖酶XynZF-2的熱穩定性，為該酶的后續研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S：本實驗室保存。大腸桿菌JM109、BL21（DE3）及表達質粒pET-28a：Novagen公司。

質粒：重組質粒pET-28a-xynZF-2：本實驗室構建并保存。

工具酶和生化試劑：T4脫氧核糖核酸鏈接酶（T4 deoxyribonucleic acidligase，T4DNALigase）、限制性內切酶、DL1000 DNA Marker、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，x-gal）：TaKaRa公司；DNA質粒提取試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；蛋白分子量標準：碧云天生物技術有限公司；DNA片段回收試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術公司；其他化學試劑為國產或進口分析純。

1.2儀器與設備

C1000梯度PCR擴增儀：美國Bio-Rad公司；DYY-2穩壓穩流電泳儀：北京市六一儀器廠；DC-0506低溫恒溫槽：上海比朗儀器有限公司；HZQ-F160A恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；Neofuge 23R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1同源序列比對以及同源建模

通過ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析木聚糖酶的理化性質，利用Phyre2對木聚糖酶同源建模，并通過DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶三維結構。

1.3.2定點突變和重組表達載體pET-28a-xyn-E27C構建

以pET-28a-xynZF-2為模板，采用重疊延伸聚合酶鏈式反應（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE PCR）法［15］，引物見表1，擴增得到突變基因E27C，割膠回收。EcoRⅠ、HindⅢ限制性內切酶對突變基因E27C和空質粒pET-28a進行雙酶切，37℃、3 h，電泳酶切產物，切膠回收。用T4 DNA Ligase連接以上兩種雙酶切產物，16℃過夜，轉化大腸桿菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（kalamycin，Kan）抗性的LB固體培養基，構建重組大腸桿菌BL21-pET-28a-xyn-E27C。篩選陽性單克隆菌落，提取重組質粒進行驗證，送金唯智公司測序。

表1　突變基因引物Table 1 The primers of mutated gene

1.3.3重組木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C的表達與純化

IPTG誘導表達重組菌株BL21/pET-28a-xyn-E27C，采用超聲波細胞破碎等方法提取粗酶液，具體方法見參考文獻［16］。采用鎳金屬螯合親和層析柱純化重組木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C，收集洗脫樣品液，即為重組原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C，對XynZF-2、Xyn-E27C進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測（5%濃縮膠，15%分離膠）［17］。

1.3.4重組木聚糖酶活性測定

木聚糖酶活性測定：3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［18］。添加1 mL適當稀釋的酶液于1.5 mL的0.5%樺木木聚糖溶液中，40℃水浴反應15 min，加DNS終止反應，測定OD值。將此反應條件下每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個單位，U。

1.3.5重組木聚糖酶酶學性質比較及分析

對純化后的重組原酶（XynZF-2）和突變酶（Xyn-E27C）進行酶學性質分析，測定溫度和pH值對重組木聚糖酶酶活性的影響［17］。

2　結果與分析

2.1重組木聚糖酶同源序列比對建模及突變位點確定

圖1　XynZF-2（A）與Xyn-E27C（B）同源建模Fig.1 Homology modeling of XynZF-2（A）and Xyn-E27C（B）

將原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C的氨基酸序列提交到Phyre2，分別自動同源序列比對建模，結果如圖1所示，原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C基本相似，都是由1個α-螺旋和2個β-折疊片層組成，屬于GH11家族木聚糖酶。利用DNAMAN6.0以及DS ViewerPro6.0對氨基酸序列、木聚糖酶XynZF-2結構分析，發現在N-端的β-折疊區域的B1鏈從第22個氨基酸開始到第29氨基酸結束，依次為：PSSTGENN，由此發現，除第27位點的谷氨酸帶負電荷外，其他氨基酸均不帶電的中性氨基酸，為穩定B1鏈與酶分子內外部的相互作用，將第27位點帶負電荷的谷氨酸隨機突變為相對分子質量相近且不帶電荷的中性氨基酸（半胱氨酸）。

2.2定點突變和重組表達載體構建

采用重疊延伸PCR對突變基因E27C進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳PCR產物（見圖2、圖3）。通過DNAMAN6.0對突變基因E27C限制性酶切位點進行分析，發現突變基因E27C不含EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點，利用引物對突變基因E27C引入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點，通過EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切將突變基因E27C克隆在載體pET-28a上，構建重組表達載體。

圖2　突變基因xyn-E27C上下游片段PCR擴增Fig.2 PCR amplification of the upstream and downstream fragments of mutated genexyn-E27C

圖3　突變基因xyn-E27C的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of mutated genexyn-E27C

2.3重組木聚糖酶在大腸桿菌中表達和純化

將重組質粒pET-28a-xyn-E27C轉化大腸桿菌BL21（DE3），構建大腸桿菌工程菌。經IPTG誘導表達，通過細胞破碎提取粗酶液，對含有His6標簽的原酶和突變酶，經鎳金屬螯合親及層析柱法得到純化的重組木聚糖酶，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化的木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C。由圖4可見，原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C均在32 ku處有明顯條帶，突變酶Xyn-E27C在相對分子質量上與原酶XynZF-2一致。

圖4　木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of XynZF-2 and Xyn-E27C

2.4酶學性質比較與分析

2.4.1重組木聚糖酶與原酶最適溫度及熱穩定性比較

按1.3.5方法測定原酶與突變酶最適溫度（Topt）結果如圖5所示，突變酶Xyn-E27C的Topt為45℃，較原酶XynZF-2（Topt=40℃）提高了5℃，最適溫度有一定提高。由圖6可見，40℃保溫1 h，突變酶Xyn-E27C相對酶活性下降至保溫處理前的61.8%，較原酶XynZF-2（42.0%）有大幅度的提高，且突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/240℃為100 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=55 min）提高了45 min。在45℃條件下突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃為24 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=7 min）提高了14 min。可見，突變酶Xyn-E27C相比原酶XynZF-2熱穩定性明顯改善。

圖5　重組木聚糖酶最適溫度的比較Fig.5 Comparison of the optimum temperature of recombinant xylanase

圖6　重組木聚糖酶熱穩定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability of recombinant xylanase

2.4.2重組木聚糖酶與原酶最適pH及pH穩定性比較

分析pH對XynZF-2和Xyn-E27C酶活性的影響發現，突變酶Xyn-E27C的最適pH值為5.5（原酶XynZF-2，pH 5.0）（圖7），最適pH有明顯改變，而在pH 5.0～9.0，兩種酶的殘余酶活性都在80%以上，pH穩定性基本不變（圖8）。

圖7　重組木聚糖酶最適pH的比較Fig.7 Comparison of the optimal pH for recombinant xylanase

圖8　重組木聚糖酶pH的穩定性比較Fig.8 Comparison of the stability of recombinant xylanase pH

2.5討論

通過生物信息學等方法，在Phyre2上對XynZF-2同源建模，并用DS ViewerPro6.0觀察分析建模結果，發現XynZF-2屬于GH11家族木聚糖酶，在原酶XynZF-2的B1鏈上引入中性氨基酸，增加中性氨基酸含量，降低了B1鏈上的氨基酸在溶液中的溶解度，從而減少了B1鏈與溶液中水分子的相互作用，有利于維持蛋白分子完整的空間構象，穩定分子內部構象。為了進一步減少B1鏈與水分子的相互作用，增強分子內部穩定性，以穩定B1鏈的構象，從而穩定酶分子整體的構象，這可能是突變酶Xyn-E27C熱穩定性得到提高的重要因素。

在如今的工業應用中，對耐高溫木聚糖酶應用和需求越來越廣泛。木聚糖酶作為一種重要的酶制劑在許多工業應用環節之中具有潛力和價值，對木聚糖酶的熱穩定性改造已成為廣泛關注的熱點［9］。隨著生物技術的不斷發展，按照人類需求把木聚糖酶改造成符合工業要求的酶已經成為可能影響木聚糖酶熱穩定性的因素有很多。研究表明，GH11家族木聚糖酶的N-端區域對其熱穩定有重要的作用，很多研究已通過對木聚糖酶N-端氨基酸定點突變，改善了其熱穩定性［19］，如XIONG H R等［20］對里氏木霉來源的木聚糖酶N端和中部β-折疊處引入二硫鍵，在65℃條件下，突變酶DBl的半衰期比野生酶提高約112倍。運用生物信息學的方法分析比對木聚糖酶的分子結構，可以有效確定與熱穩定相關區域，為木聚糖酶分子的改造提供了便利。

3　結論

本研究通過對XynZF-2進行生物信息學分析，將第27個位點的谷氨酸突變為半胱氨酸，使突變酶Xyn-E27C的最適溫度相比原酶XynZF-2提高了5℃。突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃，相比原酶增加了17 min，酶的熱穩定性得到了很大提高。這為木聚糖酶Xyn-E27C后續的研究提供了理論依據。

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Effect of introducing neutral amino acids residues on the thermostability of xylanases XynZF-2

CHEN Yawen，ZHOU Chenyan*，XIE Jingjing，SUO Jingqi，WEI Yangyang，LI Tongbiao
（School of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China）

The xylanase XynZF-2 fromAspergillus nigerXZ-3S was analyzed by bioinformatics.Neutral amino acids residues（Cys）were introduced at the N-terminus.The mutated genexyn-E27Cwas amplified by site-directed mutagenesis ofE27Cand expressed inEscherichia coliBL21（DE3）. According to the enzyme properties analysis and compared to the recombinant XynZF-2，results showed that the optimum temperature of mutant Xyn-E27C was 45℃，which was increased by 5℃.At 40℃，compared to XynZF-2（t1/245℃=55 min），the t1/245℃of the mutated Xyn-E27C was 100 min，which was increased by 45 min.At 45℃，compared to XynZF-2（t1/245℃=7 min），the half-life of the mutated Xyn-E27C was 24 min，which was increased by 17 min.The optimum pH of mutated Xyn-E27C was increased from 5.0 to 5.5，while the pH stability range was from pH 5.0 to 9.0.Therefore，E27C site-directed mutagenesis had important effect on the thermal stability and pH of xylanase XynZF-2.

xylanase；thermostability；site-directed mutagenesis；neutral amino acids residues

Q55

A

0254-5071（2015）10-0027-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.007

2015-09-22

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201410472028）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（13A180861）；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目（2011GGJS-125）；新鄉醫學院科研項目培育基金（2013ZD113）

陳亞文（1993-），女，本科生，研究方向為生物工程。

周晨妍（1979-），女，副教授，博士，研究方向為微生物酶工程。