溶劑法提取藕節(jié)中鞣質(zhì)的工藝優(yōu)化

文 洋，譚 君，譚 斌，劉仲華，何長(zhǎng)征

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙410128； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙410000）

我國(guó)是蓮藕的原產(chǎn)地之一，蓮藕資源非常豐富。藕節(jié)是指去除須根的蓮的干燥根莖節(jié)部，無氣味，味甘、澀，有較好的凝血、止血及散瘀功效[1-4]。目前，市場(chǎng)上對(duì)止血藥的需求量很大，除了手術(shù)必備以外，日常生活中的磕碰損傷也經(jīng)常用到此藥。而對(duì)于那些長(zhǎng)期患有血液病的病人更加意義重大，如再生障礙性貧血等，這類患者長(zhǎng)期食用藕節(jié)湯，能較好地改善病情，有益于疾病的緩解及身體的康復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)，藕節(jié)的止血功效主要與其富含鞣質(zhì)有關(guān)[5-6]。藕節(jié)中的鞣質(zhì)在具備收斂、止血、促凝血[7-8]功效的同時(shí)，還有較強(qiáng)的抗氧化作用[9]；也兼具鞣質(zhì)類物質(zhì)共同的藥理活性，如抑菌、抗病毒、抗腫瘤、護(hù)肝益腎等活性[10]。通常，將藕節(jié)加工成藕節(jié)炭，其止血活性部位的主要成分為3-表白樺脂酸[11-14]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于藕節(jié)的研究主要集中在其止血特性以及藕節(jié)炭的成分測(cè)定等方面[15-16]，也有針對(duì)藕節(jié)中活性成分的提制工藝[17-22]和檢測(cè)方法[23-25]的相關(guān)研究。筆者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)藕節(jié)中鞣質(zhì)的溶劑提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用磷鉬鎢酸比色法對(duì)提取的鞣質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以確定藕節(jié)中鞣質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)，為藕節(jié)中鞣質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)利用打下基礎(chǔ)；同時(shí)，試驗(yàn)是以日常廢棄的藕節(jié)為材料提取生物活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了廢棄物的再利用，創(chuàng)造了較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 FZ-102 微型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司），Lab Tech 可見- 紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司），SK3300LH 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），電子分析天平（SHIMADZU、AUW 220D），實(shí)驗(yàn)室常見的玻璃儀器。

1.1.2 主要試劑 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%，成都曼斯特生物科技有限公司），食用乙醇、甲醇（分析純，青島凱祥化工有限公司），鎢酸鈉、磷鎢酸（分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠），無水碳酸鈉（分析純，重慶北培精細(xì)化工廠），鹽酸（分析純，天津凱諾化工有限公司），溴水、磷酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 磷鉬鎢酸試劑的配制 取鎢酸鈉100 g、鉬酸鈉25 g，加水700 m L 使其溶解，加100 m L 鹽酸、250 m L 磷酸，加熱回流10 h，放冷，再加150 g 硫酸鋰、50 m L 水和0.2 m L 溴水，煮沸除去殘留的溴（約15 min），冷卻，加水稀釋至1 000 m L，過濾即得。

1.2.2 供試樣制備 將新鮮藕節(jié)粉碎，準(zhǔn)確稱取10.0 g 于500 m L 帶塞錐形瓶中，在不同工藝下進(jìn)行提取，待提取液冷卻后，抽濾至100 m L 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，即為提取樣品。

1.2.3 鞣質(zhì)含量的檢測(cè) 吸取2.0 m L 提取樣品置于25 m L 容量瓶中，加磷鉬鎢酸試劑1.0 m L，加水10 m L，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的空白試劑做參比，在λmax處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計(jì)算鞣質(zhì)的含量。

式中：k，表示提取樣品的稀釋倍數(shù)；C，表示鞣質(zhì)濃度（mg/m L）；V，表示提取樣品定容后的溶液體積（m L）；W，表示稱取的新鮮藕節(jié)的質(zhì)量（mg）。

1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的確定 將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g 放入棕色容量瓶中，定容至100 m L，再從其中取5 m L 溶液至于50 m L 容量瓶中定容，制得濃度為0.5 mg/m L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密吸取2.0 m L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.5 mg/m L），置25 m L 棕色量瓶中，加1.0 m L磷鉬鎢酸試液、10 m L 水，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 m in，以空白試劑做參比，在400～900 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)繪制吸收曲線，根據(jù)最大吸收峰來確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考中國(guó)藥典2005 版中鞣質(zhì)含量的測(cè)定方法，將沒食子酸作為檢測(cè)藕節(jié)中鞣質(zhì)含量的對(duì)照品。分別準(zhǔn)確移取1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 m L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.5 mg/m L）置于25 m L 棕色容量瓶中，各加磷鉬鎢酸試液1.0 m L，再分別加10.5、9.0、7.5、6.0、4.5 m L 水，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，得濃度依次為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/m L 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，搖勻，放置30 m in，以空白試劑做參比，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 單因素試驗(yàn) （1）料液比。精確稱取10.00 g 經(jīng)處理的藕節(jié)樣品，分別加入80%的乙醇溶液20、50、80、110、140 m L（即料液比1︰2、1︰5、1︰8、1︰11、1︰14），置于40℃搖床震蕩提取2.5 h，抽濾；重復(fù)1次；濾液合并于250 m L 容量瓶中定容（1︰14 料液比處理的提取液定容至500 m L），搖勻，再依次從中吸取1.0 m L 提取液稀釋至10 m L（定容500 m L 的提取液不稀釋），按照1.2.3 的步驟進(jìn)行檢測(cè)。（2）乙醇濃度。精確稱取10.00 g 經(jīng)處理后的藕節(jié)樣品，分別用35%、50%、65%、80%、95%的乙醇溶液進(jìn)行提取，料液比為1︰11，提取時(shí)間為2.5 h，溫度為40℃；重復(fù)1次；將兩次提取的溶液合并，抽濾定容同上，按照1.2.3的步驟進(jìn)行檢測(cè)。（3）提取溫度。精確稱取10.00 g 經(jīng)處理后的藕節(jié)樣品，用80%的乙醇溶液分別在30、40、50、60℃溫度下提取，料液比為1︰11，提取時(shí)間為2.5 h；重復(fù)1 次；合并兩次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進(jìn)行檢測(cè)。（4）提取時(shí)間。精確稱取10.00 g 經(jīng)處理后的藕節(jié)樣品，用80%的乙醇溶液（料液比為1︰11）在50℃下分別提取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h；重復(fù)1 次；合并兩次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進(jìn)行檢測(cè)。（5）提取次數(shù)。精確稱取10.00 g 經(jīng)處理后的藕節(jié)樣品，用80%的乙醇溶液在40℃下提取，料液比為1︰11，提取時(shí)間為2.5 h；分別提取1、2、3、4 次，合并各次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 正交試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)明確正交試驗(yàn)的4個(gè)考察因素為：A 料液比、B 乙醇濃度、C 提取溫度和D 提取時(shí)間；各因素的最佳水平范圍依次為：料液比1∶8～1∶11、乙醇濃度70%～90%、提取溫度50℃附近、提取時(shí)間4.5 h 左右。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1。各組試驗(yàn)均提取3次，合并提取液抽濾后，稀釋10 倍的提取液按1.2.3的步驟進(jìn)行檢測(cè)。

表1 L9（34）的因素水平

1.2.8 最佳工藝的驗(yàn)證 分別稱取10.00g 藕節(jié)樣品5 份，按照正交試驗(yàn)獲得的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行提取，稀釋后測(cè)定鞣質(zhì)的得率，以驗(yàn)證最佳工藝的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)

由400～900 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收曲線可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）為760 nm，與中國(guó)藥典2005 版鞣質(zhì)含量的測(cè)定方法中沒食子酸的λmax=754 nm 有稍許出入，考慮到760 nm 和754 nm 處沒食子酸的吸光度值相差很小，根據(jù)實(shí)驗(yàn)事實(shí)確定沒食子酸的λmax為760 nm，并以此作為藕節(jié)中鞣質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，該標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.03～0.15 mg/m L 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性系數(shù)R 達(dá)到0.998 7（R2=0.997 4），符合測(cè)定要求。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比 從圖2a 中可以看出，料液比為1︰8和1︰11 的處理，鞣質(zhì)的得率較高，但當(dāng)料液比為1︰14 時(shí)，鞣質(zhì)的得率反而降低了，可能是因?yàn)榕汗?jié)中的鞣質(zhì)降解了（鞣質(zhì)的得率是占10 g 新鮮藕節(jié)的百分比，因而不存在因?yàn)槿軇┝考哟蠖a(chǎn)生稀釋作用。鞣質(zhì)本身屬于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酚類化合物，在空氣中易于氧化，或者水解）。而根據(jù)圖中趨勢(shì)可知，在1︰8 和1︰11 的料液比之間應(yīng)存在曲線的最高點(diǎn)，故在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中將該因素的水平范圍定為1︰8～1︰11 之間。

2.3.2 乙醇濃度 由圖2 b 可以看出，在乙醇濃度為35%～80%范圍內(nèi)時(shí)，鞣質(zhì)的得率隨著乙醇濃度的增加而升高，但當(dāng)乙醇濃度高于80%時(shí)，鞣質(zhì)的得率隨著乙醇濃度的增加而降低，故在正交試驗(yàn)中，選擇70%～90%的乙醇濃度作為該因素的考察范圍。

2.3.3 提取溫度 由圖2 c 可知，隨著提取溫度的升高，得率逐漸升高，當(dāng)提取溫度達(dá)50℃時(shí)，得率升高的趨勢(shì)趨于平緩，50℃與60℃下的得率未見明顯差別。而有關(guān)資料表明，在鞣質(zhì)的提取過程中，溫度過高會(huì)使鞣質(zhì)分解為其他物質(zhì)，這些物質(zhì)在760 nm 波長(zhǎng)處仍有較大吸收峰，從而干擾試驗(yàn)結(jié)果。因此，正交試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的提取溫度范圍為40～50℃。

2.3.4 提取時(shí)間 由圖2 d 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藕節(jié)中鞣質(zhì)的得率表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)；在提取4.5 h 時(shí)，藕節(jié)中鞣質(zhì)的得率最高。這可能是由于藕節(jié)中的鞣質(zhì)不穩(wěn)定，提取時(shí)間過長(zhǎng)，藕節(jié)中的鞣質(zhì)被降解了。因此，在設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)中，提取時(shí)間范圍設(shè)置為4.0～5.0 h。

2.3.5 提取次數(shù) 不同提取次數(shù)的測(cè)定結(jié)果顯示，僅提取1 次時(shí)，藕節(jié)中的鞣質(zhì)提取不夠充分，得率僅為0.86%；提取2 次時(shí)，得率增加為1.17%；提取3 次時(shí)，得率增加至1.33%；提取4 次時(shí)，得率沒有明顯的改善，為1.35%。從經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、生態(tài)環(huán)保的角度考慮，選擇3 次為最佳提取次數(shù)。

圖2 不同提取條件下藕節(jié)中鞣質(zhì)的得率

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，采用乙醇提取藕節(jié)中的鞣質(zhì)最佳工藝參數(shù)為A2B2C3D1（試驗(yàn)5），即料液比1︰10、乙醇濃度80%、提取溫度50℃、提取時(shí)間4.0 h，得率為1.289 4%。由極差值可知，各因素對(duì)提取效果影響的大小順序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間，即料液比為最主要的影響因素，乙醇濃度次之，其中提取時(shí)間對(duì)藕節(jié)中鞣質(zhì)的得率影響較小。由表3 的方差分析結(jié)果可知，料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均沒有極顯著性意義。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

按正交試驗(yàn)得出的最佳工藝對(duì)藕節(jié)中的鞣質(zhì)進(jìn)行重復(fù)提取，鞣質(zhì)的得率分別為1.320 4%、1.299 0%、1.283 8%、1.390 4%、1.180 6%，重復(fù)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.85%，從而證實(shí)該方法精密度高、重復(fù)性好，具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

生產(chǎn)上鞣質(zhì)的高效提取需要綜合考慮安全、成本和環(huán)保3個(gè)方面的因素，而乙醇作為食品工業(yè)常用的有機(jī)溶劑，廉價(jià)易得，提取效果顯著，相對(duì)安全，易于揮發(fā)脫除，便于回收循環(huán)利用，故研究中選取乙醇作為提取溶劑中的有機(jī)相，結(jié)合水的配比對(duì)藕節(jié)進(jìn)行萃取，分別考察料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)等單因素對(duì)得率的影響。

正交試驗(yàn)的因素增加1個(gè)，其不同因素和水平組合的試驗(yàn)次數(shù)將顯著增加。例如：4 因素3 水平的正交設(shè)計(jì)需要做9 次試驗(yàn)L9（34），而5 因素4 水平的正交設(shè)計(jì)需要做16 次試驗(yàn)L16（45），工作量顯著增加。而從單因素試驗(yàn)結(jié)果來看，提取次數(shù)與其他的各因素之間沒有明顯的交互關(guān)系，故確定提取次數(shù)為3 次后，對(duì)其他4個(gè)因素進(jìn)行3 水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定藕節(jié)中鞣質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)。

該研究在利用磷鉬鎢酸/干酪素法測(cè)定藕節(jié)中鞣質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)從料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)等方面對(duì)藕節(jié)中鞣質(zhì)類物質(zhì)的乙醇提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在料液比1︰10、乙醇濃度80%、提取溫度50℃、提取時(shí)間4.0 h 的條件下，藕節(jié)中鞣質(zhì)的得率平均可達(dá)1.294 8%，最高得率可達(dá)1.390 4%。同時(shí)，該工藝操作簡(jiǎn)單方便，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，為藕節(jié)中鞣質(zhì)類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[2]寶書說藥.藕節(jié)[N].中國(guó)中醫(yī)藥報(bào)，2013-03-04（5）.

[3]陳 菊，張家驪.藕節(jié)止血作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23（2）：345-350.

[4]虞慧娟，孫付軍，靳光乾，等.藕節(jié)炭活性部位止血機(jī)制的研究[J].中藥藥理與臨床，2011，27（3）：65-67.

[5]孫付軍，靳光乾，張 敏，等.藕節(jié)炒炭止血有效活性部位及其成分篩選研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（1）：177-178.

[6]張朔生，袁 野.蓮藕、藕節(jié)及其炭制品止血作用的比較[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，10（2）：13-14.

[7]曲筱靜.藕節(jié)促凝血活性物質(zhì)的篩選及其作用機(jī)制的初步研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[8]曲筱靜，張家驪，周新華，等.藕節(jié)促凝血有效組分的篩選及凝血作用研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：259-261.

[9]李 泱.蓮藕藕節(jié)鞣質(zhì)提取純化及其抗氧化活性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10]栗世婷.鞣質(zhì)藥理活性的研究新進(jìn)展[J].疾病監(jiān)測(cè)與控制，2010，（7）：395-397.

[11]劉善新，王 萌，靳光乾，等.藕節(jié)炭中3-表白樺脂酸含量的測(cè)定[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（6）：54-55.

[12]劉善新，靳光乾.HPLC法測(cè)定不同地區(qū)市售藕節(jié)中3-表白樺脂酸[J].中藥材，2010，33（3）：393-394.

[13]張 陽，張 昭，劉海濤，等.藕節(jié)藥材中3-表白樺脂酸的含量測(cè)定及HPLC指紋圖譜的研究[J].藥物分析雜志，2014，34（1）：178-183.

[14]劉善新，靳光乾.藕節(jié)炒炭浸出物、3-表白樺脂酸、HPLC特征圖譜變化[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（1）：71-74.

[15]劉善新，侯立靜，靳光乾，等.藕節(jié)炒炭鞣質(zhì)的含量變化研究[J].中藥材，2009，32（2）：187-189.

[16]單玲玲，劉善新，靳光乾，等.藕節(jié)、藕節(jié)炭HPLC特征圖譜研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（9）：67-71.

[17]李永強(qiáng)，楊士花，秦 源，等.響應(yīng)面法優(yōu)化藕節(jié)鞣質(zhì)提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2012，48（2）：36-48.

[18]鄒姝姝，蔣 東，董 杰，等.藕節(jié)鞣質(zhì)提取工藝[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，25（2）：59-85.

[19]李會(huì)端，李云興.酶輔助法提取藕節(jié)中總黃酮及·OH清除活性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，3（3）：383-386.

[20]李 泱，王清章，嚴(yán)守雷，等.藕節(jié)鞣質(zhì)提取率的數(shù)學(xué)模型研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（12）：41-44.

[21]許瑞波，何 靜，王新新，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選藕節(jié)多糖的提取工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（10）：2447-2449.

[22]陳 菊.藕節(jié)功能性成分的提取分離及產(chǎn)品開發(fā)[D].無錫：江南大學(xué)，2009.

[23]嚴(yán)守雷，王清章，彭光華.藕節(jié)中總酚含量的福林法測(cè)定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（4）：412-414.

[24]劉善新，張新軍，靳光乾.藕節(jié)的TLC鑒別和浸出物含量測(cè)定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（6）：944-946.

[25]劉善新，候立靜，靳光乾，等.藕節(jié)中鞣質(zhì)的含量測(cè)定研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（2）：238-240.