高耐鎘硫酸鹽還原菌的篩選及鑒定

周冰玉，吳迎奔，陳 薇，劉 標，許 雋，尹紅梅，賀月林

（湖南省微生物研究院， 湖南 長沙410009）

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量含重金屬離子的廢水排放到環(huán)境中，引起了嚴重的重金屬污染。一直以來，由于未得到有效治理，重金屬逐漸向江河湖海、地下水以及廢水流經區(qū)域的土壤中積累，給農業(yè)生產和人類健康帶來嚴重威脅，尤其是重金屬鎘污染已成為一個全球性問題[1-2]。因此，廢水中重金屬污染治理是當前急需解決的重大問題，也是目前許多科研工作者的研究熱點。

目前，廢水中鎘污染的治理方法主要有物理法、化學法和微生物修復法。但物理和化學方法所使用的材料較昂貴且使用壽命短，處理廢水的成本較高，易引起二次污染。而微生物修復法因其具有來源豐富、處理成本相對較低、對環(huán)境影響小等優(yōu)點，引起了科研工作者的廣泛關注[3-4]。

硫酸鹽還原菌是指一類能把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物及元素硫還原形成硫化氫的細菌的統(tǒng)稱[5]。與其他類型的重金屬微生物修復菌劑相比，用硫酸鹽還原菌修復廢水鎘污染最大的優(yōu)勢在于其去除水體中鎘離子的效率更高，而且對多種重金屬離子都有去除效果[6]。作為一種可高效去除廢水中重金屬離子的微生物，硫酸鹽還原菌越來越被研究者們重視，從而廣泛應用到工業(yè)廢水、灌溉用水、養(yǎng)殖廢水等的修復領域[7]。實驗室從重金屬污染廢水中分離了12 株硫酸鹽還原菌，并對其鎘耐受能力和吸附能力進行了測試，以期為硫酸鹽還原菌處理含鎘廢水提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廢水樣品采自湖南某地工業(yè)區(qū)。試驗所用的富集和固體培養(yǎng)基參照國家農業(yè)部成都沼氣所的配方。富集培養(yǎng)基成分為：NaCl 2.0 g/L、Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、Na2SO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、70%乳酸鈉5 m l/L、酵母膏1.0 g/L，pH 值7.5。固體培養(yǎng)基即在上述培養(yǎng)基中按照20%的比例加入瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫酸鹽還原菌的富集培養(yǎng) 取1 m L 廢水樣品加入裝有100 m L 液體培養(yǎng)基的鹽水瓶中，蓋好瓶蓋后放入厭氧培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變成墨黑色，用醋酸鉛試紙檢測有大量H2S 生成后轉接，如此重復5 次，每次接種量1%。

1.2.2 硫酸鹽還原菌的分離純化 將富集培養(yǎng)后的菌液稀釋到10-6，平板劃線，用封口膜密封后置厭氧培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d 后，從中挑取長勢良好、濃黑色的單菌落于斜面中保存。

1.2.3 硫酸鹽還原菌的初步鑒定 在光學顯微鏡下觀察活體細菌的運動特征、細胞形態(tài)；硫酸鹽還原菌的革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色方法見《微生物學實驗》[8]。

1.2.4 菌株對鎘的耐受能力 將獲得的12 株硫酸鹽還原菌，按2%的接種量接種于含5、10、20、40、80 mg/L 鎘離子的富集培養(yǎng)基中，于35℃、150 r/m in 厭氧培養(yǎng)7 d，然后將富集培養(yǎng)后的菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，用封口膜密封后置厭氧培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)，挑取各平板上的單菌落進行斜面保藏。

1.2.5 菌株對鎘的吸附能力 將獲得的4 株耐鎘硫酸鹽還原菌，按2%的接種量接種于含20、40、80 mg/L鎘的富集培養(yǎng)基中，于35℃、150 r/m in厭氧培養(yǎng)7 d，設3個重復，以接等量無菌水和死菌體為對照。針筒取樣，10 000 r/m in離心10 m in，取上清液備用，對照采用同樣方法進行處理。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定各處理上清液中鎘的濃度。各菌株對培養(yǎng)液中鎘的吸附率（%）=（C0-Ct）/C0×100。其中，C0為蒸餾水對照上清液中鎘的濃度；Ct為吸附后上清液中鎘的濃度。

2 結果與分析

2.1 硫酸鹽還原菌的分離及初步鑒定

經多次富集培養(yǎng)和分離，獲得12 株硫酸鹽還原菌，分別編號為S-1～S-12。12 株菌株的菌落特征和細胞形態(tài)特征見表1。其共同特征為菌落黑色，同為革蘭氏陰性菌，細胞形狀主要為桿狀或弧狀，不產芽孢，單極生鞭毛，運動特征以翻滾式運動和旋轉式運動為主；各菌株的區(qū)別僅在于菌體大小不同。對照《伯杰氏系統(tǒng)細菌分類學手冊》中對脫硫弧菌屬硫酸鹽還原菌的描述：多弧狀，偶有桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性，初步判定分離得到的菌株屬脫硫弧菌屬。

2.2 耐鎘硫酸鹽還原菌的分離純化

表1 各硫酸鹽還原菌的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)特征的比較

對12 株硫酸鹽還原菌進行分離純化，結果如表2所示，當培養(yǎng)基中鎘離子濃度提高到80 mg/L，仍有4株菌株可以生長，分別為S-3、S-11、S-5 和S-10。

2.3 高耐鎘硫酸鹽還原菌對鎘的吸附能力

4 株耐鎘硫酸鹽還原菌經過7 d 培養(yǎng)后，各菌株對不同濃度含鎘培養(yǎng)液（分別含鎘20、40、80 mg/L）中Cd+的吸附能力見圖1～圖3。當培養(yǎng)液含鎘20 mg/L時，各菌株對鎘的吸附能力較強，吸附率在87.27%±1.097%～84.37%±3.758%之間；隨著鎘濃度的增加，各菌株對鎘的吸附能力隨之降低；在鎘離子濃度為80 mg/L 的培養(yǎng)液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力較強，分別為70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。耐鎘能力相對較弱的菌株卻表現出較強的鎘吸附能力。

當培養(yǎng)基中鎘離子初始濃度為20 mg/L 時，死菌體細胞對溶液中鎘的吸附率為30.00%±3.835%～39.43%±2.639%；隨著鎘濃度的增加，死菌體對鎘的吸附能力亦隨之降低；在鎘離子濃度為80 mg/L 的培養(yǎng)液中，死菌體對鎘離子的吸附能力僅8.033%±0.404 1%～8.90 0%±0.435 9%。

表2 硫酸鹽還原菌在不同濃度含鎘培養(yǎng)基中生長情況

圖1 4 株耐鎘菌株對含鎘20 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+的吸附

圖2 4 株耐鎘菌株對含鎘40 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+ 的吸附

圖3 4 株耐鎘菌株對含鎘80 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+ 的吸附

3 結論與討論

經過多次的富集分離，得到4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌，其細胞呈弧形，無芽孢，為革蘭氏陰性，初步判定4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌屬脫硫弧菌屬。下一步擬通過生理生化、16S rDNA 基因序列、G+C 含量的測定以及DNA-DNA 雜交分析進一步判斷4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌在分類學上的地位。

鎘耐受試驗結果表明，S-3、S-5、S-10、S-11 菌株具有較強的鎘耐受能力，在鎘濃度高達80 mg/L 時，仍能正常生長。4 株菌的鎘吸附試驗結果顯示，各菌株活菌體對溶液中的鎘均有較強的吸附能力。在含鎘80 mg/L 的培養(yǎng)液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力較強，分別達70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。

利用吸附能力強的微生物修復重金屬污染水體，可以克服物理和化學方法易造成二次污染的缺點，具有良好的應用前景。試驗獲得的4個菌株對鎘吸附能力強，效率高，有望成為處理含鎘廢水的理想菌種。但是，菌株S-3、S-5、S-10、S-11 的吸附機理及其對實際重金屬礦山污染廢水的處理效果仍需進一步研究。

[1]劉麗君.水環(huán)境中鎘污染處理的研究進展[J].環(huán)境科學與管理，2012，37（6）：124-127.

[2]黃寶圣.鎘的生物毒性及其防治策略[J].生物學通報，2012，40（11）：26-28.

[3]沈 萍，朱國偉.含鎘廢水處理方法的比較[J].污染防治技術，2010，23（6）：56-59.

[4]Carlos G R，Victor R T，Bruno G G.Cadmium and zinc removal from aqueous solutions by Bacillus jeotgali:pH，salinity and temperature effects[J].Bioresource Technology，2008，99（4）：3864-3870.

[5]馬保國，胡振琪，張明亮，等.高效硫酸鹽還原菌的分離鑒定及其特性研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（2）：608-611.

[6]Sponza D T.Investigation ofextracellular polymer substances（EPS）and physicochemical properties of different activated sludge flocs under steady-state conditions[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，32（3-4）：375-385.

[7]潘響亮，王建龍，張道勇，等.硫酸鹽還原菌混合菌群胞外聚合物對Cu2+的吸附和機理[J].水處理技術，2005，31（9）：25-28.

[8]袁麗紅.微生物學實驗[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010.