F26-T菌株對水稻稻曲病生防效果的初步研究

鄢一笑，劉前剛，楊習群，陳海榮，杜 宇，靳 磊，魏小武，張德元

（湖南省微生物研究院， 湖南 長沙410009）

近年來，湖南省水稻稻曲病發生呈逐年加重的趨勢，流行性強，危害嚴重，不僅造成大量癟粒病粒，導致稻谷產量及品質下降，而且病粒含有毒素，這種毒素能引起人畜慢性中毒，極大的影響了糧食高產穩產和食品安全[1]。目前，還未發現水稻稻曲病高抗品種，生產上主要依賴愛苗、萬興、好力克等化學農藥來防治[2]。尤其是某些農藥的毒性大、殘留高，對生態平衡和人們的健康產生了較大影響，成為當前防治水稻稻曲病亟待解決的問題[3]。試驗從易于定殖到水稻葉部的葉際微生物著手，以期篩選出水稻稻曲病的高效防治菌株，更好地發揮生防微生物的防病潛能，為最終培育出對人畜安全的優質水稻品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

稻曲病病原菌從湖南長沙市郊稻田稻曲病發病植株病穗中采集提取?？估Ｆ?00 μg/m L 和抗病原真菌雙標記突變菌株——F26 菌株和F26-T 菌株，由湖南省微生物研究院植保微生物室分離及選育。供試水稻品種為華優451，由湖南湘東種業有限公司提供。供試培養基有：（1）PSA 培養基，馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 m L；（2）PS 培養基，馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 m L；（3）改良高氏一號培養基（F26 菌株活化培養用），可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 m L；（4）選擇抗性培養基（F26-T 菌株選擇性培養用），在改良高氏一號培養基中加入利福平溶液，使其在培養基中濃度為200 μg/m L。

1.2 試驗方法

1.2.1 F26-T 菌株對水稻稻曲病菌的拮抗作用 參照程明淵等[4]的試驗方法，將水稻稻曲病菌（橘黃色稻曲球）接種到PS 培養液中，5～8 d 鏡檢，待產生分生孢子后，將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合后倒平板，置培養箱中培養2 d 后，再將供試拮抗菌株點接到平板，每個平板對稱點接兩個菌株，然后置26℃培養箱中培養，5 d 后觀察并記錄結果，以平均抑菌帶寬、抑菌圈平均直徑/拮抗菌落平均直徑之比來衡量生防菌的拮抗效果。

1.2.2 F26-T 菌株發酵濾液對稻曲病菌的抗生作用將供試拮抗菌株活化后轉接到高氏改良一號培養液中，置28℃，180 r/min 搖床震蕩發酵6 d，發酵液經滅菌濾紙過濾，濾液轉移至50 m L 離心管，4℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾后備用。將稻曲病菌接種到PS 培養液中，待產生分生孢子后，將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合倒平板，待平板冷卻后，置一無菌牛津杯（內徑0.7 cm，高0.9 cm）于平板中心，將300 μL 的F26-T 菌株發酵濾液原液、F26-T 菌株發酵濾液稀釋5 倍液和F26-T 菌株發酵濾液稀釋10 倍液分別加入到不同的牛津杯中，以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無菌水為對照，置26℃恒溫箱中培養，5 d 后觀察并記錄各處理的抑菌圈直徑。

1.2.3 F26-T 菌株孢子懸液對水稻稻曲病的田間防效 將培養好的放線菌F26 用無菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液，于水稻有穗分化期分3 次連續3 d 噴霧接種孢子懸液，以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜，以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無菌水為正負對照，每個處理3 次重復，每個小區8 m2（2 m×4 m），各小區間隔不小于2 m，隨機排列。待水稻黃熟期，采用五點取樣法，每個重復調查25 叢水稻，調查指標有總稻穗數和病稻穗數，并以病穗數為單位，采用5 級分級法，計算病情指數和防治效果[5]。水稻稻曲病分級標準如下：0 級：無??；1 級：每穗有1個病粒；2 級：每穗有2～4個病粒；3 級：每穗有5～7個病粒；4 級：每穗有8～10個病粒；5 級：每穗有10個病粒以上。

1.2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況 水稻種子用1%次氯酸鈉浸種消毒5 m in，用無菌水漂洗3 次，然后播種，采取常規措施對水稻進行施肥澆灌等田間管理。將培養好的放線菌F26 用無菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液，于水稻有穗分化期分3 次連續3 d 噴霧，以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜。分別于第3 次噴霧接種后0、1、3、6、9、12 和15 d 采集水稻葉片，取樣時兼顧水稻植株上、中和下部葉片。利用抗性選擇培養基采用梯度稀釋法檢測F26-T 菌株在水稻稻葉中的數量，計算單位重量水稻葉片中F26-T菌株的定殖量。

2 結果與分析

2.1 F26-T 菌株對水稻稻曲病菌的拮抗作用

試驗結果顯示，經PSA 平板對峙培養5 d 后，F26-T 菌株對水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.5 mm，其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.05；而初始菌株F26 對水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.7 mm，其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.12。兩菌株的差異不明顯，表明F26-T 突變菌株和初始菌株F26 對水稻稻曲病菌具有相同的拮抗作用。

2.2 F26-T 菌株發酵濾液對稻曲病菌的抗生作用

試驗結果顯示，F26-T 發酵濾液原液的平均抑菌圈直徑為25.2 mm，明顯優于5%井岡霉素水劑500倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑（20.1 mm）；F26-T 發酵濾液5 倍稀釋液的平均抑菌圈直徑為20.5 mm，與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑相當；稀釋10 倍的F26-T 發酵濾液平均抑菌圈直徑為17.2 mm，稍差于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理；而無菌水對照處理的平均抑菌圈直徑為0 mm。

2.3 F26-T 菌株孢子懸液對水稻稻曲病的田間防效

從表1 中可以看出，無菌水處理的稻曲病病情指數極顯著高于其他處理；孢子懸液原液、孢子懸液5倍稀釋液和孢子懸液10 倍稀釋液對水稻稻曲病的田間相對防效分別為76.93%、66.23%和53.96%；其中，F26-T 菌株孢子懸液原液對水稻稻曲病的田間防效極顯著高于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理；而F26-T 菌株孢子懸液5 倍稀釋液和10 倍稀釋液對水稻稻曲病的田間防效與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理無顯著性差異。

表1 F26-T 菌株孢子懸液對水稻稻曲病的田間防效

2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

由圖1 可知，接種后第0～1 天，F26-T 菌落數下降較為明顯；第1～6 天，菌落數逐漸增加，并上升至最高；第6～15 天，菌落數逐漸趨于穩定；以接種后第6天的菌落數最多，為8.54×103cfu/m L。因此，F26-T 菌株在水稻葉圍定殖情況為：接種后第1 天該菌株數量下降明顯，第3～6 天該菌株逐漸適應，并進入生長繁殖期，第9～15 天該菌株在水稻葉圍的數量相對穩定。

圖1 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

3 結論與討論

研究結果表明，F26-T 菌株對水稻稻曲病病原菌表現出較強的拮抗和抗生作用。該菌株在水稻葉圍噴霧接種后第3～6 天就已逐漸適應葉圍環境，進入定殖生長階段，這是其對水稻稻曲病有生防作用的主要原因之一；其孢子懸液原液、5 倍稀釋液和10 倍稀釋液的田間相對防效分別為76.93%、66.23%和53.96%，效果較為理想。該研究為水稻稻曲病的防治提供了一條新的途徑，但該菌株的生防機制以及在其定殖點菌落生長和產素的適宜條件等還需進一步探索。

趙新華等[6]和Nair 等[7]分別從水稻和咖啡葉圍成功篩選出芽孢桿菌菌株，這些菌株對水稻白葉枯病菌及多種植物病原真菌均表現出較強拮抗作用。自然界中，水稻（寄主）、病原物（稻曲病病菌）、生防微生物和環境之間的關系是極為復雜的，需明確水稻葉部、穗部生防微生物與病原物及其他生物、分泌物和各種環境因子之間的相互作用及動態變化規律，才能有效地調控無機與有機環境，為生防微生物創造適宜環境，改進其對環境的適應能力，以更好地發揮生防微生物的防病促生等功能。

[1]鄒克琴，胡東維，王為民，等.水稻稻曲病的研究進展[J].浙江農業科學，2012，（5）：704-706.

[2]張 舒，張求東，羅漢剛，等.水稻稻曲病的藥效試驗和防治適期的選定[J].華中農業大學學報，2007，26（2）：178-181.

[3]尹小樂，陳志誼，劉永鋒，等.稻曲病拮抗細菌的篩選與評價[J].江蘇農業學報，2011，27（5）：983-989.

[4]程明淵，劉洪濤，閻萬元，等.人工培養條件下稻曲病菌厚垣孢子產生因素初探[J].吉林農業科學，1996，（2）：62-64．

[5]何明遠，張戰泓，劉建宇，等.27.12%堿式硫酸銅懸浮劑（銅高尚）防治水稻稻曲病田間藥效試驗[J].新農藥，2006，10（1）：26-27.

[6]趙新華，陳衛良，李德葆，等.白葉枯病菌拮抗菌篩選及水稻葉圍微生物互作研究初報[J].中國水稻科學，2000，14（3）：161-164.

[7]Nair JR，Singh G，Sekar V.Isolation and characterization of a novel Bacillus strain from coffee phyllosphere showing antifungal activity[J].JouralofAppiled Microbiology，2002，93（5）：772-880.