靶向VEGFR-3載阿霉素脂質微泡超聲造影劑體外顯影及尋靶能力的實驗研究

葉 鳴 ，王志剛 ，周 鴻 ，牛誠誠 ，陳昶宇 ，劉 瑩

（1.成都市第三人民醫院-重慶醫科大學附屬成都第二臨床學院，四川 成都 610010；2.重慶醫科大學超聲影像研究所，重慶 400010；3.中南大學湘雅二院超聲科，湖南 長沙 410000）

隨著超聲分子顯像技術的不斷發展，靶向超聲造影劑的設計及制備已成為目前的研究熱點。靶向超聲造影劑可以作為治療藥物或基因的載體，通過血液循環特異性地聚集于靶組織，觀察靶組織在分子或細胞水平的特異性顯像，在腫瘤治療方面顯示出巨大的潛力[1-2]。已有研究發現，血管內皮生長因子-C在誘導腫瘤淋巴管形成和促進腫瘤的淋巴結播散中起到至關重要的作用。而阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在臨床抗腫瘤淋巴管新生和腫瘤淋巴轉移方面具有良好應用前景[3]。

本研究采用抗VEGFR-3單克隆抗體為配體，制備出靶向載藥脂質微泡超聲造影劑，探討其在體外的顯影效果及在人淋巴管內皮細胞上的體外尋靶能力，為下一步動物實驗及臨床應用打下實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

DSPE-PEG（2000）Biotin（Avanti，美國）；DPPC、DPPE、DPPA （Lipoid， 德國）； 阿霉素(Adriamycin)（Sigma，美國）；抗人VEGFR-3單克隆抗體（R&D systems，美國）；鏈親和素（Sigma，美國）；N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯 （Biotiny-N-hy-droxy-succinimide，BNHS）HABA/Avidin 試劑（Sigma，美國）；熒光染料 DiI（Sigma，美國）；THZ-C 恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；高速冷凍離心機5804R（德國Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus CKX41，Japan）。

1.2 生物素化抗體的制備及檢測

將抗人VEGFR-3單抗透析，加入到微孔濾膜管中，然后再向管中加入一定量的BNHS（1 mg/mL），孵育后離心，再加入PBS，混勻后再次離心，去除外管濾液，加入PBS制成樣品溶液。將PBS加入比色皿中作為空白對照管，在另一比色皿中加入一定量HABA/Avidin試劑，分別測定于加入樣品溶液前后其500 nm處的吸光度值A1、A2；在第三個比色皿中加入一定比例的PBS和樣品溶液，并測定其在500 nm的吸光度值A3，根據HABA/Avidin試劑說明書中的公式計算，檢測抗體的生物素化程度[4]。

1.3 載藥靶向超聲微泡的制備

稱量阿霉素、成膜磷脂材料DSPE-PEG（2000）Biotin、DPPC、DPPE、DPPA， 按照一定比例混合，加入少量熒光染料DiI，溶于一定量1∶1的甲醛和三氯甲烷中，待甲醛和三氯甲烷自然揮發完全后，加入一定量的甘油和PBS，放入45℃的水域中孵育半小時，再沖入氟碳氣體，經50 s振蕩后得到載阿霉素脂質超聲微泡。將上述制得的載藥微泡加入過量的鏈親和素中，低溫振蕩孵育半小時后，反復低溫低速離心洗滌；然后加入上述所制備的生物素化抗人VEGFR-3單克隆抗體，再經低溫孵育半小時，反復低溫低速離心洗滌，便得到靶向VEGFR-3載阿霉素脂質微泡超聲造影劑。

1.4 靶向載藥超聲脂質微泡的體外顯影實驗

將一系列按倍比稀釋的靶向載藥脂質微泡 （微泡平均濃度分別為 3.10×109個/mL、1.55×109個/mL、0.75×109個/mL）置入用凝膠（1%）制成的孔洞模型中，以PBS作為對照。采用Philips iU22超聲診斷儀，基波成像模式，掃查聲束與孔洞長軸垂直，應用機械指數（MI 0.7）的超聲采集各孔中的超聲圖像。

1.5 倒置熒光顯微鏡下觀察靶向載藥脂質微泡超聲造影劑對人淋巴管內皮細胞的結合情況

取對數生長期人淋巴管內皮細胞，以1×104/孔的密度接種于置有消毒蓋玻片的6孔板底部。待細胞貼壁后，繼續培養24 h，制備細胞爬片。預設為靶向造影劑實驗組和空白對照組，各3張。吸干培養液，每組爬片采取不同操作：①靶向造影劑實驗組內加入靶向載藥脂質微泡超聲造影劑200 μL；②空白對照組內加入非靶向載藥脂質微泡超聲造影劑200 μL。于 CO2培養箱內孵育 1 h。1 h 后，取出爬片，以PBS緩沖液反復沖洗每張片5次，在光鏡和熒光顯微鏡下觀察結合情況。

2 結果

2.1 抗體生物素化程度

根據HABA/Avidin試劑說明書公式算出，每個單克隆抗體分子平均可與9個生物素分子結合。

2.2 載藥靶向微泡的物理性質

光鏡下觀察顯示微泡呈球形，表面光滑，粒徑大小較一致，分散較均勻，平均粒徑為1.66 μm（圖1）。

圖1 靶向載藥微泡粒徑圖。馬爾文激光粒徑儀測量靶向載藥微泡的平均粒徑為1.66 μm。Figure 1.Size of VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents containing adriamycin.Itsmean diameter:1.66 μm.

2.3 靶向載藥超聲脂質微泡的體外顯影效果

體外顯影結果顯示，與PBS對比，靶向載藥脂質微泡顯示高回聲，且回聲強度隨微泡濃度減小呈下降趨勢（圖2）。

2.4 倒置熒光顯微鏡下觀察靶向載藥超聲脂質微泡造影劑對人淋巴管內皮細胞的尋靶能力

400倍光鏡下觀察到：①載藥靶向微泡造影劑組，較多量載藥靶向微泡造影劑與人淋巴管內皮細胞緊密結合，主要分布在細胞周邊以及細胞壁游離面上（圖3）。②空白對照組，在PBS的反復沖洗下，細胞周圍觀察不到或僅見少量造影劑黏附。400倍熒光顯微下觀察，在與白光同一視野下：①載藥靶向微泡造影劑實驗組，可見大量靶向造影劑形成圓環，發出強烈紅色熒光；②空白對照組，未見或僅見少量的熒光。

圖2 靶向載藥超聲脂質微泡體外顯影。1：PBS（MI=0.7）；2～4：靶向載藥超聲脂質微泡濃度分別為：0.75×109個/mL、1.55×109個/mL、3.10×109個/mL（MI=0.7）；5～8：靶向載藥超聲脂質微泡濃度為0.75×109個/mL，MI依次為0.6、0.5、0.4、0.3。 圖3 靶向載藥造影劑實驗組結合情況圖。光鏡下及熒光鏡下觀察到較多的載藥靶向超聲微泡造影劑與人淋巴管內皮細胞緊密結合，且主要分布在細胞周邊以及細胞壁游離面上。Figure 2. 1:PBS(MI=0.7);2～4:VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents concentration:0.75×109/mL,1.55×109/mL,3.10×109/mL(MI=0.7);5～8:its concentration:0.75×109/mL,their MI were 0.6,0.5,0.4 and 0.3. Figure 3. Under electron microscope and light microscope,more closely conjugation of trageted lipid microbubble ultrasound contrast agents and human lymphatic endothelial cells,were displayed,and located around cells areas and free surface of cell walls.

3 討論

隨著靶向脂質微泡制備技術的不斷發展，超聲分子顯像技術應運而生。超聲分子顯像主要是指經靜脈輸入靶向超聲微泡造影劑，在體內通過受體與配體結合的方式，使靶向造影劑特異性停留于靶組織，應用超聲造影技術來觀察靶區在組織水平、細胞水平的成像，能夠反映病變區組織在分子基礎方面的變化。近年來，針對腫瘤淋巴管和轉移淋巴結的超聲分子成像研究逐漸成為熱點[5]。

在實體腫瘤中，腫瘤細胞或其他間質細胞高表達VEGF-C、VEGF-D，通過激活VEGFR-3誘導淋巴管生成，增加的淋巴管密度使得腫瘤更容易進入淋巴管從而運輸到區域淋巴結。由于腫瘤細胞的迅速生長，腫瘤內機械性壓力和滲透壓顯著升高，周圍的淋巴管不易伸入腫瘤組織，導致腫瘤內的淋巴管比周圍的淋巴管稀疏而塌陷。淋巴管新生主要發生在腫瘤邊緣和周圍，腫瘤中央部缺乏或無淋巴管。因此，根據VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信號通路以及其他信號通路在腫瘤轉移中的重要性，靶向此通路可能阻斷腫瘤淋巴結轉移[6-7]。

對于那些不能手術的患者，通常采取化療方式進行治療，阿霉素是常用的腫瘤化療藥物之一，可用于多種腫瘤的治療如肝癌，乳腺癌，軟組織肉瘤等，然而目前臨床應用制劑質量不穩定，且全身用藥毒副反應嚴重，限制了其臨床療效的發揮。

本實驗采用脂質微泡，可發揮其穩定性好、安全無毒，易于裝載阿霉素等優點；生物素-親和素連接法高效、穩定的將載藥微泡與抗人VEGFR-3單克隆抗體相連，使其靶向淋巴管內皮細胞后，可以阻斷VEGFR-3表達，抑制腫瘤誘導的淋巴管內皮細胞增殖，從而在一定程度上能抗腫瘤淋巴管新生和淋巴轉移的作用。一定能量超聲波觸發下，釋放阿霉素瞬時提高靶組織藥物濃度，一定程度上局部治療淋巴結內轉移性腫瘤細胞，為減少藥物在體內的全身毒副反應打下基礎[8]。

綜上所述，本研究制備的靶向VEGFR-3的載阿霉素脂質微泡超聲造影劑，可以牢固的結合到淋巴管內皮細胞表面，在一定能量超聲波觸發下，釋放阿霉素瞬時提高靶組織藥物濃度，對定位及局部治療腫瘤轉移淋巴結有重要作用，為進一步在體內實驗奠定較好的基礎。

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[1]王志剛.超聲分子影像學研究進展 [J].中國醫學影像技術，2009，25（6）：921-923.

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[5]牛誠誠，鄭元義，王志剛，等.靶向VEGFR-3超聲造影劑的制備及其體外尋靶實驗研究 [J].中國超聲醫學雜志，2012，28（7）：585-587.

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