藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞內氧化應激水平的影響△

潘慧敏，姜保平，樂亮，肖偉，許利嘉*，肖培根

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193； 2.國家教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室 北京 100193)

·健康產業·

藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞內氧化應激水平的影響△

潘慧敏1，2，姜保平1，2，樂亮1，肖偉1，2，許利嘉1，2*，肖培根1，2

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193； 2.國家教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室 北京 100193)

目的：探討藤茶主要成分，二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素及楊梅苷對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗及細胞內活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、乳酸(LD)、三磷酸腺苷(ATP)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的影響。方法：將HepG2細胞分為正常對照組、胰島素抵抗模型組和樣品干預組。用高糖(55 mmol·L-1)誘導HepG2細胞，建立胰島素抵抗模型，用MTT法檢測樣品對HepG2細胞增殖的影響；用葡萄糖氧化酶法檢測上清中葡萄糖的含量；用分光光度法檢測細胞內MDA、LD含量及SOD、CAT活性；用熒光酶標儀檢測細胞內ROS和ATP水平。結果：五個化合物在有效濃度范圍內對HepG2細胞增殖無顯著影響；樣品干預組葡萄糖消耗量較模型組顯著升高；與模型組相比，五個化合物某個或某幾個濃度組顯著降低細胞內MDA含量，提高SOD、CAT活性及ATP水平；沒食子酸、二氫槲皮素和楊梅苷顯著降低細胞內ROS水平；除二氫楊梅素外，其余四個化合物均能降低細胞內LD含量。結論：胰島素抵抗HepG2細胞與對照組細胞相比有較高的氧化應激水平，抗氧化能力減弱。藤茶主要成分能通過降低細胞的氧化應激水平，增加細胞的抗氧化能力，從而預防胰島素抵抗。

藤茶；HepG2細胞；胰島素抵抗；氧化應激

胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是指機體對一定量胰島素的生物學反應低于預計正常水平的一種現象，也就是機體對胰島素的反應減退。胰島素抵抗被認為是糖尿病、肥胖、脂代謝紊亂等慢性代謝性疾病的共同的生理病理學基礎[1]，因此對于胰島素抵抗發生機制的研究具有非常重要的意義。

多種致病因素如高血糖、高游離脂肪酸血癥以及促炎因子分泌增加均可導致胰島素抵抗。研究表明，上述因素導致胰島素敏感性下降的共同機制之一是促進機體的氧化應激[2-3]。氧化應激是指機體內活性氧(ROS)的生成增加和(或)清除能力降低，導致ROS的生成和清除失衡。ROS具有重要的生理作用，但過量則引起分子、細胞和機體的損傷[4-5]，導致細胞內MDA、LD含量升高，SOD、CAT活性下降[6]，ATP水平降低[7]。大量研究表明，胰島素抵抗的發生與機體的氧化應激狀態有著密不可分的關系，過多的氧自由基促發胰島素抵抗，而胰島素抵抗又反過來加重氧化應激[8]。機體氧化應激水平越高，抗氧化防御能力越弱，胰島素抵抗的程度就越高。因此，降低高血糖細胞的氧化應激水平，是改善細胞胰島素抵抗的途徑之一。

藤茶，系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelosisgrossedentata(Hand.-Mazz)W.T.Wang的嫩莖葉[9]，是中國民間流傳已久的古茶。文獻報道，藤茶具有顯著的抗氧化活性[10]。前期研究發現，藤茶具有顯著的預防胰島素抵抗的活性。藤茶總黃酮及二氫楊梅素能夠明顯降低高脂飲食大鼠的血脂水平，對多種動物模型有明顯的降低血糖的作用，而對正常小鼠血糖無明顯影響[11-12]。然而，藤茶是否能通過改善氧化應激水平而預防胰島素抵抗，這方面的研究至今尚無報道。

二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素及楊梅苷為藤茶中的主要成分，其中以二氫楊梅素含量最高。本實驗首次研究了藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、乳酸(lactic acid，LD)、三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate，ATP)的影響，探討藤茶預防胰島素抵抗的物質基礎及可能的作用機制，為藤茶的深度開發，資源進一步的充分利用，提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

DL-CJ-IND-Ⅱ超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；3100型CO2細胞培養箱：美國Thermo Forma公司；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Fluoroskan Ascent FL型熒光/化學發光分析儀：美國Thermo Forma公司；MQX200型酶標儀：美國BioTek公司；

1.2 試劑

DMEM低糖培養基：HyClone公司；胎牛血清：美國Gibco公司；青-鏈霉素：HyClone公司；0.25%胰蛋白酶：美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)：國藥集團化學試劑有限公司；四氮甲唑藍(MTT)：美國Sigma公司；牛胰島素：美國Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；超氧化物歧化酶檢測試劑盒：日本同仁化學研究所；乳酸測試盒：南京建成生物工程研究所；活性氧檢測試劑盒、脂質氧化檢測試劑盒、過氧化氫檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術研究所。其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 材料

HepG2細胞株：中國醫學科學院基礎研究所；二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。

2 方法

2.1 HepG2胰島素抵抗細胞模型的建立

根據文獻方法[13]加以改進，取對數生長期細胞制成細胞懸液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基稀釋，以105個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板，100 μL/孔，于37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞貼壁后，棄去上清液，加入新鮮配制的不同濃度的高糖溶液100 μL/孔繼續于37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養不同的時間，用預熱的PBS沖洗2遍后，用1 nmol·L-1胰島素刺激15 min，葡萄糖測定試劑盒檢測細胞培養液上清的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。最終選定以55 mmol·L-1的高糖溶液作用24 h建立胰島素抵抗模型。

2.2 藤茶主要成分對HepG2細胞增殖的影響

取對數生長期細胞，以105個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板。將細胞分為正常對照組和樣品干預組，樣品干預組換無血清的含藥培養基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1及400 μmol·L-1，每個濃度設8個復孔，加藥24 h后，移出培養液，將5 mg·mL-1的MTT原液與無血清DMEM培養基按體積比1∶>9配成MTT溶液，每孔加入100 μL，4 h后換二甲基亞砜，震蕩10 min，在酶標儀570 nm波長下測定各孔吸光度值。

2.3 藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的影響

根據文獻方法[13]加以改進，取對數生長期細胞，以105個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板。將細胞分為正常對照組、模型組及樣品干預組。樣品干預組換無血清的含藥培養基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1及40 μmol·L-1，每個濃度設8個復孔，加藥24 h后，上述各組(除空白對照組)再分別加高糖(55 mmol·L-1)處理24 h后。各組細胞用預熱的PBS沖洗2遍，用1 nmol·L-1胰島素刺激15 min，用葡萄糖測定試劑盒檢測細胞培養液上清的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.4 藤茶主要成分生化指標測定

根據文獻方法[13]加以改進，取對數生長期細胞，以105個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板。將細胞分為正常對照組、模型組及樣品干預組。樣品干預組換無血清的含藥培養基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20及40 μmol·L-1，每個濃度設8個復孔，加藥24 h后，上述各組(除空白對照組)再分別加高糖(55 mmol·L-1)處理24 h后。收集細胞，按照試劑盒方法處理細胞樣品并測定ROS、MDA、SOD、CAT、LD、ATP水平。

2.5 統計分析

結果均以±s形式表示，所有數據采用SPSS17.0統計學軟件進行單因素方差分析，組內比較采用Duncan’ s檢驗，P<0.05有顯著性差異。

3 結果

3.1 藤茶主要成分對HepG2細胞增殖的影響

圖1 藤茶主要成分對HepG2細胞增殖的影響

圖1表明，五個化合物濃度在100 μmol·L-1范圍內時，細胞存活率均接近100%，對細胞增殖無顯著影響。當樣品濃度增大到150 μmol·L-1時，二氫楊梅素、二氫槲皮素、楊梅素才開始對細胞增殖起到抑制作用。

3.2 藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗影響

如表1所示，模型組細胞糖消耗量明顯低于正常對照組(P<0.01)，說明建模成功。用藤茶各部位預處理24 h后，再給予高糖刺激，與模型組相比，除楊梅素5 μmol·L-1、10 μmol·L-1和40 μmol·L-1組外，其余各化合物各個濃度組均能不同程度的促進HepG2細胞糖消耗。

3.3 藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞內ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影響

由表2可知，模型組ROS、MDA、LD含量較正常對照組顯著升高，SOD、CAT活性及ATP水平與正常對照組相比顯著降低。與模型組相比，沒食子酸、二氫槲皮素及楊梅苷(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)處理后ROS含量顯著降低；二氫楊梅素和二氫槲皮素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、楊梅素及楊梅苷各濃度組MDA含量也明顯下降；與此同時，二氫楊梅素和楊梅苷(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸和楊梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及二氫槲皮素各濃度組SOD活性較模型組有顯著提高；二氫楊梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1)、楊梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸、二氫槲皮素及楊梅苷各濃度組的CAT活性也顯著上升；沒食子酸和二氫槲皮各濃度組、楊梅素(40 μmol·L-1)及楊梅苷(20 μmol·L-1)LD含量顯著降低；二氫楊梅素和沒食子酸各濃度組、二氫槲皮素和楊梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及楊梅苷(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)ATP含量顯著升高。

表1 藤茶主要成分對IR-HepG2細胞糖消耗影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與正常對照組相比，##P<0.01。

表2 藤茶主要成分對胰島素抵抗HepG2細胞內ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與正常對照組相比，##P<0.01。

4 結論

機體發生氧化應激損傷，細胞內ROS水平升高；MDA作為脂質過氧化最重要的產物之一，可以反映體內脂質過氧化的程度，間接地反映細胞氧化損傷程度；而體內的抗氧化系統，如SOD、CAT等則能減少氧自由基對細胞的損傷，它們活性的高低反映機體的抗氧化能力[6]。胰島素抵抗引起細胞內葡萄糖無氧酵解的過程增強，乳酸生成增加。乳酸在細胞內積聚，會導致細胞滲透壓增高，線粒體腫脹和破裂，影響線粒體呼吸功能而發生能量代謝障礙。高糖使細胞內乳酸和氧自由基與脂質過氧化物生成增加，又會損傷線粒體的能量代謝，細胞內ATP水平下降[14，15]。本實驗以高糖誘導HepG2細胞產生胰島素抵抗，結果表明，在有效濃度范圍內，各樣品對細胞存活率無顯著影響。高糖可以引起細胞內ROS、MDA水平增高，SOD、CAT活性下降，其氧化/抗氧化體系的穩態失衡，而沒食子酸、二氫槲皮素和楊梅苷能顯著降低細胞內的ROS水平，二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素和楊梅苷均能明顯增加胰島素抵抗HepG2細胞SOD、CAT的活性，降低MDA水平。本研究經過高糖造模后，細胞內液乳酸含量明顯增加，而損傷前給予供試樣品預處理可抑制乳酸含量的增加。

以上研究結果提示藤茶可能通過降低細胞內活性氧水平、抑制脂質過氧化反應及提高細胞內抗氧化酶的活性來減少自由基對細胞的損傷，增加細胞的抗氧化功能，減輕細胞的氧化應激，從而預防胰島素抵抗。同時，可能也與減輕細胞代謝性酸中毒，提高ATP水平，改善細胞能量代謝有關。

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EffectsofmaincompoundsfromAmpelosisgrossedentataonoxidativestressininsulin-resistantHepG2cells

PANHuimin1，2，JIANGBaoping1，2，LELiang1，XIAOWei1，2，XULijia1，2*，XIAOPeigen1，2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100093，China； 2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

Objective：To investigate the influence of the main compounds：dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromAmpelopsisgrossedentataon glucose consumption，ROS，MAD，SOD，CAT，LD and ATP in insulin-resistant HepG2 cells.Methods：HepG2 cells were divided into control group，model group and sample groups.Insulin-resistant cells model was induced by high concentration of glucose (55 mmol·L-1).The proliferation of cells were detected by 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenylterazolium bromide (MTT) assay.The contents of glucose in culture supematant were measured by the glucose oxidase peroxides (GOD) method. The contents of MDA，SOD，CAT and LD were observed by spectrophotometric method.The contents of ROS and ATP were analyzed on a fluorescence microplate.Results：The five compounds had little impact on the cells proliferation within the range of effective concentration.The five compounds increased the glucose consumption significantly in insulin-resistant cells.After treated with the five compounds，the contents of SOD，CAT and ATP increased significantly，while that of MDA decreased.Dihydroquercetin，gallic acid and myricitrin were able to reduce the contents of ROS and LD significantly.Meanwhile，the content of LD also could be reduced significantly by myricetin.Conclusion：Dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromA.grossedentatacan alleviate oxidative stress in the insulin-resistant HepG2 cells.

Ampelosisgrossedentata；HepG2 cells；insulin-resistant；oxidative stress

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.019

2015-01-07)

國家自然科學基金面上項目(81274188)：四種別樣茶改善胰島素抵抗的物質基礎和作用機制研究

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許利嘉，副研究員，博士，研究方向：別樣茶的物質基礎研究；TEL：010-57833165 E-mail：xulijia@hotmail.com