厚樸揮發性成分的HS-SPME-GC指紋圖譜建立△

雷咪，楊敏，張林碧*，王華清，劉義梅，黃傳奇，廖朝林

(1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；2.湖北省農業科學院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000)

·基礎研究·

厚樸揮發性成分的HS-SPME-GC指紋圖譜建立△

雷咪1，楊敏1，張林碧1*，王華清1，劉義梅1，黃傳奇1，廖朝林2

(1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；2.湖北省農業科學院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000)

目的：應用頂空固相微萃取-氣相色譜(HS-SPME-GC)技術，建立厚樸揮發性成分的指紋圖譜。方法：篩選了固相微萃取(SPME)的3種不同萃取涂層的萃取頭：100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)和85 μm聚丙烯酸酯(PA)；優化了萃取溫度、萃取時間和萃取量；采用HP-50毛細管GC色譜柱，對13批厚樸藥材進行比較分析，建立了厚樸揮發性成分的指紋圖譜。結果：選定其中10批優質樣品建立共有模式，相似度均在0.9以上，其重復性、穩定性均符合有關規定。結論：該方法簡便、快速、環保，無需溶劑樣品前處理，樣品用量小，可作為中藥材質量控制的又一手段，其試驗數據為厚樸的質量控制提供了參考。

厚樸；頂空固相微萃取；氣相色譜-質譜聯用法；氣相色譜法；指紋圖譜

厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.及凹葉厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、枝皮和根皮，主產于四川、湖北[1]。現代藥理研究證明，厚樸揮發油具有增加胃液、唾液分泌，加快腸胃蠕動以及健胃等藥理活性[2]。

中藥材揮發性成分的GC指紋圖譜研究中，常采用水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法、超聲提取法提取揮發油[3-6]。水蒸氣蒸餾法的高溫易引起熱不穩定化合物的分解[7]；超臨界CO2流體萃取法的設備昂貴、操作步驟繁瑣，還易引入塑料增塑劑或提取出蠟質等成分[8]；超聲提取法的影響因素較多，藥材粒度、超聲波頻率等設置不當會導致提取效果差異較大[9]。固相微萃取(SPME)是集萃取、濃縮、進樣于一體，無溶劑樣品前處理的新技術，適合對揮發性和半揮發性有機物的分析[10]。目前已有大量運用頂空固相微萃取(HS-SPME)技術分析鑒定中藥材揮發性成分的報道[11-14]，可見采用頂空固相微萃取氣質聯用法可為中藥材指紋圖譜的建立提供有效的方法。本研究采用HS-SPME-GC技術，對13批厚樸藥材的揮發性成分進行比較分析，建立了厚樸揮發性成分的指紋圖譜，為厚樸的內在質量控制提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 6890N氣相色譜儀、Chemstation色譜工作站、Agilent 6890/5973氣質聯用儀、Nist譜庫(美國Agilent公司)；BP-211D 型十萬分之一分析天平(德國Satorius)；手動SPME裝置、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、85 μm聚丙烯酸酯(PA)萃取頭(美國Supelco公司)；PC-220溫度調節式磁力攪拌器(美國Corning公司)；BP-211D電子天平(北京Sartorius公司)。

“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004版”軟件(國家藥典委員會)。

13批厚樸藥材直接從產地采集或購于各地藥店，經湖北中醫藥大學張林碧教授鑒定，2個批次為凹葉厚樸，其他均為厚樸。藥材來源見表1。

表1 13批厚樸樣品情況

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-50毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣：高純He；恒流：1.3 mL·min-1；程序升溫：50 ℃(1 min)，以4 ℃·min-1上升到140 ℃(2 min)，以2 ℃·min-1上升到180 ℃，以12 ℃·min-1上升到280 ℃，恒溫5 min；進樣口溫度：260 ℃；分流比為15∶1；氫火焰離子化檢測器(FID)溫度：280 ℃；尾吹氣(高純氮)：35 mL·min-1。

2.1.2 質譜條件 倍增器電壓為1800 V；接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃；電離方式為EI，電子能量為70 eV；掃描質量范圍：35～550 amu。

2.1.3 HS-SPME萃取方法 精密稱取一定質量的厚樸藥材粉末(過60目篩)，于12 mL頂空瓶中加蓋密封，插入SPME萃取頭，在一定溫度下，頂空萃取一定時間后拔出，立刻插入GC進樣口，260 ℃解析3 min，按2.1.1項下色譜條件進行GC分析。

2.2 萃取條件的優化

——進一步增強醫療救助托底保障能力，確保年度救助限額內農村貧困人口政策范圍內個人自付住院醫療費用救助比例不低于70%，對特殊困難的進一步加大傾斜救助力度。

2.2.1 萃取頭的選擇 分別選擇PDMS/DVB(65 μm)、PDMS(100 μm)和PA(85 μm)3種不同涂層的萃取頭，按2.1.1項下色譜條件、2.1.3項下方法進行GC分析，結果見圖1。氣相色譜圖顯示：PA萃取的峰個數太少；不論是出峰數目還是總峰面積，PDMS/DVB的萃取效率都優于PDMS。綜合考慮以上因素，選擇PDMS/DVB萃取頭。

2.2.2 萃取溫度的選擇 加熱溫度分別選擇50、60、70、80、90 ℃，按2.1.3項下方法操作，見圖2～3。結果表明，隨著萃取溫度的升高，保留時間在30 min后各色譜峰峰面積明顯增大，但30 min前的各色譜峰峰面積則有所減少。在90 ℃時雖然總峰面積與峰個數有所增加，但差異性明顯加大，導致部分低沸點物質的響應值被淹沒。綜合考慮總色譜峰峰面積及峰個數，選定萃取溫度為70 ℃，此時的峰面積相對較大且穩定，峰個數較多。

2.2.3 萃取時間的選擇 萃取時間分別選擇30、45、60、75、90 min，按2.1.3項下操作，結果見圖4～5。在60 min時，萃取的總峰面積及峰個數均較高，而90 min時峰型較差，所以選定萃取時間為60 min。

2.2.4 萃取量的選擇 分別選擇0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g的厚樸細粉，按2.1.3項下操作，結果見圖6～7。結果表明，萃取量太低時，峰個數及峰面積都不佳，適當增加萃取量后二者均有所提高，量太大導致峰型變差、峰面積有所下降。0.2 g時出峰個數最多，因此選擇0.2 g為萃取量。

圖1 3種SPME萃取頭的GC色譜圖

圖2 萃取溫度對峰面積的影響

圖3 萃取溫度對峰個數的影響

圖4 萃取時間對峰面積的影響

圖5 萃取時間對峰個數的影響

圖6 取樣量對峰面積的影響

圖7 取樣量對峰個數的影響

2.3 方法學考察

2.3.1 重復性試驗 取同一批厚樸藥材(13號)，按2.1.3項下操作，連續進樣5次，各圖譜的相似度均在0.997以上，表明該方法的重復性良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一批厚樸藥材(13號)，按2.1.3項下操作，分別在0、4、8、16、24、48 h進樣分析，各圖譜的相似度均在0.994以上，表明樣品成分在48 h內穩定。

2.4 指紋圖譜的建立和分析

表2 13批厚樸樣品中42個共有峰信息表

表2(續)

表3 揮發油成分GC-MS結果表

2.4.2 系統聚類分析 計算13批不同產地厚樸樣品的指紋圖譜中各共有峰相當于內參照峰的峰面積比值，得到42×13階的數據矩陣，應用“SPSS”軟件對其進行系統聚類分析，采用Ward法并利用歐氏距離平方(Squared Euclidean Distance)作為樣品測度。聚類分析將13批厚樸樣品分為2類，其中樣品1、2、3、4、5、7、13歸為Ⅰ類，其他歸為Ⅱ類。

2.4.3 相似度評價 將聚類分析結果的第Ⅰ類和Ⅱ類中的1、2、3、5、6、7、8、9、12、13號共10批樣品建立共有模式，將其導入國家藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004版A”軟件，生成對照圖譜，建立共有模式。生成的10批樣品和對照圖譜見圖8。再將對照譜圖和13批樣品色譜圖全譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統檢驗版(2004B)”，樣品與對照圖譜的相似度數據見表4。

A.參與共有模式建立的l0批樣品色譜圖；B.生成的GC對照色譜圖1.鄰聚傘花素；2.對烯丙基苯酚；3.β-芹子烯；4.α-白菖烯；5-石竹烯氧化物；6.古巴烯；8.白菖烯；9.沉香螺貼醇；12.α-桉葉油醇；13.β-桉葉油醇；14.喇叭茶醇；16.杜松烯；19.對叔丁基苯甲醚；20.十六酸；21.亞麻油酸。圖8 參與共有模式建立的10批樣品色譜圖和生成的GC對照色譜圖

樣品編號相似度樣品編號相似度樣品編號相似度10.99760.979110.98820.98870.993120.98230.99080.997130.97040.99790.98650.993100.986

3 討論

3.1通過SPME的3種不同萃取頭選擇試驗可見：萃取頭對揮發性成分的吸附差異性取決于其涂層材料，PDMS涂層呈非極性、PA涂層呈極性、而PDMS/DVB涂層呈雙極性，故后者更適合含多種揮發性成分中藥材的吸附和分析。而涂層的厚度對待測物的吸附量和平衡時間也有一定的影響。

3.2通過萃取溫度、萃取時間和萃取量的優化可知：萃取溫度增高能增加頂空揮發性物質的濃度，有利于被測組分的萃取。但SPME是一個放熱過程，當溫度高到一定程度后，化合物的萃取量反而減少，考慮到溫度太高某些組分重疊更為嚴重，不利于樣品的定性分析，所以選擇了總峰面積相對較大且穩定，峰個數較多的70 ℃為試驗的最佳溫度。萃取時間的長短對低、高沸點物質的萃取量有顯著的影響，因此對該因素進行考察是必要的。萃取量的不同，對峰面積和個數均有影響，萃取量太低時峰面積和個數都不佳；萃取量適當增加后，二者均有所提高；萃取量太大又導致峰型變差、峰面積有所下降。本試驗還考察了樣品粒度、進樣口的解析溫度等因素，最終確定了樣品制備和GC分析的條件。

3.3本試驗還分別考察了OV-1、HP-5、HP-50和DB-WAX柱的分離效果，結果表明OV-1柱對低沸點物質的響應較低；HP-5柱對12、13號色譜峰的分離效果不佳；DB-WAX柱的最高耐受溫度為250 ℃，在程序升溫至后半段時基線出現明顯的漂移，故最終選擇分離效果理想、基線平穩的HP-50柱。

3.4建立共有模式需要不少于10批有代表性且經專家鑒定的藥材樣品，本次試驗數據顯示13批樣品的相似度均在0.9以上，未發現離群樣本。可考慮增大樣本批次，進行系統分析。

3.5厚樸中揮發油主要含醇、酮、酯及烯等成分，其中以桉葉油及其異構體為主。用GC-MS對部分成分進行了鑒定，根據樣品的譜庫檢索結果和質譜圖分析，α-桉葉油醇、β-桉葉油醇是厚樸的主要揮發性成分，鄰聚傘花素、杜松烯、β-芹子烯、杜松烯也是厚樸的共有成分。根據文獻報道和結構分析，成分中對烯丙基苯酚可能是厚樸的主要成分厚樸酚的降解產物。

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EstablishmentofFingerprintofVolatileCompoundsinMagnoliaeofficinalisCortexbyHS-SPME-GC

LEIMi1，YANGMin1，ZHANGLinbi1*，WANGHuaqing，LIUYimei，HUANGChuanqi，LIAOChaolin2

(1.CollegeofPharmacy，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.InstituteofChineseHebalMedicines，HubeiAcademyofAgriculturalScience，Enshi445000，China)

Objective：To establish the fingerprint of the volatile compounds in Magnoliae officinalis Cortex by headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography(HS-SPME-GC).Methods：The different three SPME fibers were screened and the conditions including extraction temperature，extraction time，sample quantity were optimized through the optimization of GC conditions.13 batches of samples were analyzed and compared using HP-50 capillary gas chromatographic column，the volatile components were identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Result：The samples were classified as 2 grades by cluster analysis and 10 superior samples were selected to establish the mutual models.The similarities were all above 0.9.The repeatability and stability of the method met the requirment.Conclusion：The method is simple，fast，envirnment-friendliness，less consumption of sample and can be used for the quality control.It is also reliable to evaluate the quality of Magnoliae officinalis Cortex.

Magnoliae officinalis Cortex；HS-SPME；GC-MS；GC；fingerprint

2014-08-28)

全國第四次中藥資源普查(15801448584)；湖北省衛生廳科研基金資助重點項目(2012Z-Y27)

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張林碧，教授，研究方向：中藥資源與品質研究；E mail：diqing2001putin@foxmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.005