山羊角藥材的HPLC指紋圖譜研究△

康馨元，劉睿，李春楠，錢大瑋，孫佳明，段金廒，張輝*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046)

·基礎研究·

山羊角藥材的HPLC指紋圖譜研究△

康馨元1，劉睿2，李春楠1，錢大瑋2，孫佳明1，段金廒2，張輝1*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046)

目的：建立山羊角藥材的HPLC指紋圖譜。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脫；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL·min-1。結果：建立了10個不同產地山羊角藥材的共有圖譜，確定了10個共有峰，采用液質聯用技術指認了其中4個共有峰，并采用聚類分析、主成分分析、相似度分析的方法對指紋圖譜進行了分析。結論：該方法簡便快速、專屬性強，可用于山羊角藥材的鑒別和評價。

山羊角；高效液相色譜法；指紋圖譜

山羊角為牛科山羚屬動物青羊NaemorhedusgoralHardwicke、山羊屬動物北山羊CapraibexLinnaeus的角。其首載于《本草新編》，曰其“專活死血”[1]。《吉林中草藥》指其能鎮靜、退熱、明目、止血[2]。山羊角主要有甾族、磷脂類、角蛋白、多肽及氨基酸類成分，與羚羊角的化學成分相似。研究表明，山羊角具有解熱、鎮靜、催眠[3]、鎮痛[4]、解痙、降壓等作用，且鎮靜作用較羚羊角稍強[5]。

目前，對于山羊角的研究大多集中在與羚羊角進行藥理作用及性狀上的比較和鑒別[3-7]，鮮有單獨針對山羊角的報道[8-10]。由于山羊角藥材粉末顏色均不統一，易與其他角類藥材相混淆，故本試驗收集3種可能作為山羊角混偽品的藥材進行對比分析。采用高效液相色譜法建立不同產地山羊角藥材的指紋圖譜，采用液質聯用技術對主要色譜峰進行指認，綜合運用相似度分析、聚類分析以及主成分分析方法對山羊角及其偽品色譜圖進行分析，為山羊角的鑒別提供依據，為山羊角的廣泛應用奠定基礎。

1 儀器及材料

1.1 儀器、試劑

1260系列高效液相色譜儀[包括二極管陣列檢測器(DAD)、化學工作站、自動進樣器]、1100 series LC-MS液質聯用儀[包括Agilent SL 型多級離子阱質譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測器(DAD)、自動進樣器、Chemistation 化學工作站等](美國Agilent公司)、HS2060型超聲波清洗器(HENGAO T&D)；BSA124S-CW型萬分之一電子天平(Sartorius)。

對照品尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100469-201302，140661-200903，110887-200202，100879-200202)；乙腈為色譜純(Fisher公司)；水為二次蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材

山羊角藥材來源于浙江、河北、江蘇、廣東、黑龍江、內蒙古、安徽7省共10個地區，由東豐制藥有限公司提供，由長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心張輝教授鑒定為牛科動物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，見表1。偽品包括水牛角(吉林大藥房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及綿羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角藥材來源

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取山羊角粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5 mL水，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；流動相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫，見表2。

表2 山羊角高效液相指紋圖譜梯度洗脫方式

2.2.2 質譜條件 電離源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：正負離子檢測；掃描范圍：m/z 50～800；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9 mL·min-1；霧化氣壓強：0.24 Mpa；毛細管電壓：4 kV。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性試驗 取供試品溶液(7)，分別在0、2、4、6、8、12 h進行檢測，考察各主要色譜峰與內參比峰保留時間的一致性，各主要色譜峰相對保留時間RSD均小于0.61%，相對峰面積RSD均小于2.87%。通過“中藥指紋圖譜相似度計算軟件(2004A)”計算，相似度均大于0.995，表明供試品在12 h內穩定性良好。

2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液(7)，連續進樣6次，考察各主要色譜峰與內參比峰保留時間的一致性，各主要色譜峰相對保留時間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于2.20%。通過“中藥指紋圖譜相似度計算軟件(2004A)”計算，相似度均大于0.999，表明供試品進樣精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取供試品(7)6份，同法檢測，考察各主要色譜峰與內參比峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，各主要色譜峰相對保留時間RSD均小于0.20%，相對峰面積RSD均小于4.88%。通過“中藥指紋圖譜相似度計算軟件(2004A)”計算，相似度均大于0.998，表明本法重復性良好。

2.4 樣品測定

按2.1項下方法制備10批供試品溶液，分別吸取10 μL，按2.2.1項下的色譜條件注入高效液相色譜儀，進行分析。選擇10個共有色譜峰，將色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度計算軟件(2004A)”，生成共有模式。取供試品溶液10 μL，按2.2.2項下的質譜條件注入液質聯用儀，進行檢測，結合色譜峰的紫外色譜圖、一級質譜數據和二級質譜數據進行分析，指認出3、5、6、9號峰分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷，見圖1。指認結果見表3。

2.5 山羊角指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 內參比組分的選擇 為消除測定結果的系統誤差，選定峰形對稱、峰面積較穩定的保留時間為11.3 min的7號色譜峰作為內參比組分，以便計算同種山羊角的共同特征組分的相對保留時間和相對峰面積值。結果見表4～5。

注：A.共有模式色譜圖；B.已知化合物色譜圖；3.尿嘧啶；5.次黃嘌呤；6.尿苷；9.腺苷。圖1 山羊角藥材的共有模式圖及已知化合物的高效液相色譜圖

表3 山羊角色譜峰的HPLC-DAD-ESI-MS(n)分析結果

表4 山羊角樣品10個共有峰的相對保留時間 /min

表5 山羊角樣品10個共有峰的相對峰面積

2.5.2 特征指紋圖譜的建立 采用國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度計算軟件A版”進行數據分析處理，設定安徽合肥的山羊角藥材圖譜為參照圖譜，將其他樣品測得的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，生成山羊角指紋圖譜共有模式，見圖2。不同產地山羊角藥材指紋圖譜存在一定的差異，其共有峰相對保留時間基本一致。

注：S1～S10.1～10號樣品；R.對照圖譜。圖2 10批山羊角藥材的高效液相色譜圖

2.5.3 主成分分析 應用SPSS統計學軟件，將山羊角藥材指紋圖譜的特征峰數據化(特征數據化結果為峰面積與相同峰平均峰面積之比)，輸入SPSS 17.0軟件，對10個共有峰進行主成分分析。第一主成分以3、5、8、7、2為主，占信息量的38.694%；第二主成分以9、6、5號峰為主，占信息量的18.952%；第三主成分以7、5、4為主，占信息量的17.550%。前3個主成分累計貢獻率為75.196%，基本反映了總體信息。由相關文獻[11]可知，根據各個峰在3個主成分中的總分量可計算出各個峰的權重，權重較高的峰所代表的成分在山羊角中的含量可作為分析、優選山羊角藥材的指標。通過計算，排在前幾位的依次為9、7、5、3號峰，見表6。由2.4項下特征峰的指認結果可知，此4個峰除未知的7號峰之外，全部為核苷成分。

表6 公共因子載荷矩陣表

2.5.4 聚類分析 聚類分析[12]是一種無監督的模式識別方法，依據樣品或變量在性質上的親疏程度進行分類。應用SPSS統計學軟件，將山羊角樣品及偽品藥材指紋圖譜的特征峰數據化，輸入SPSS 17.0軟件，進行聚類分析，見圖3。

注：1.安徽合肥；2.河北保定；3.廣東電白；4.河北安國；5.浙江金華；6.浙江縉云；7.黑龍江雞西；8.內蒙古阿拉善；9.浙江紹興；10.江蘇盱眙；11.綿羊角；12.牛蹄甲；13.水牛角。圖3 山羊角及偽品藥材指紋圖譜聚類分析結果

聚類分析圖反映的是各樣品的相似程度，樣品間的分類距離越小，則樣品間的差異越小，反之則越大[13]。當距離標尺在1時，樣品3、9歸為一類；當距離標尺在2時，樣品3、9與樣品5聚為一類；當距離標尺在3時，樣品2、4聚為一類；當距離標尺在4時，樣品6、8聚為一類；當距離標尺在5時，樣品3、9、5與樣品1聚為一類；當距離標尺在9時，樣品10與3、9、5、1聚為一類；當距離標尺在11、12時，樣品3、9、5、1、10依次與樣品2、4以及樣品6、8聚為一大類；當距離標尺在14時，樣品7與其他所有產地山羊角藥材聚為一類；而偽品13、12、11的距離標尺均大于17。聚類結果呈現一定的規律，相鄰的浙江、安徽、江蘇省山羊角藥材首先聚為一類，再依次與河北省、內蒙古山羊角藥材聚為一類，最后與黑龍江省藥材聚為一類，由南向北依次聚類。以距離標尺為考察指標，可以看出山羊角樣品與偽品區別明顯。

2.5.5 指紋圖譜相似度計算 應用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”軟件，校正選峰，設定匹配模式，將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜，進行色譜峰差異性評價和整體相似性評價。通過軟件得出山羊角HPLC指紋圖譜共有模式，與共有模式比較，得出10批不同產地山羊角的相似度。結果表明，10批山羊角藥材中除第1、3、10批藥材的相似度低于0.90外，其他7批藥材指紋圖譜的相似度均在0.90以上，指紋圖譜相似度均較高，見表7。

2.5.6 指紋圖譜專屬性分析 取綿羊角、牛蹄甲、水牛角藥材粉末，分別以2.1項下的方法制備供試品溶液。各吸取10 μL，按2.2.1項下的色譜條件注入高效液相色譜儀進行測定，結果見圖4。由圖可知，三者的色譜圖與山羊角藥材色譜圖有顯著差別。

表7 山羊角藥材指紋圖譜的相似度

與山羊角藥材指紋圖譜的共有峰相比，綿羊角未檢測出6、8、9號共有峰，牛蹄甲未檢測出6、9號共有峰，水牛角未檢測出9號共有峰。除色譜峰數量差異外，色譜峰峰面積也存在較大差異。因此，山羊角藥材指紋圖譜的建立為有效地鑒別混偽品綿羊角、牛蹄甲以及水牛角提供了依據。

注：A.綿羊角；B.牛蹄甲；C.水牛角。圖4 偽品高效液相色譜圖

3 討論

筆者通過對色譜柱、流動相、檢測波長以及洗脫程序的詳細考察，所采用的色譜條件對山羊角藥材分離效果較理想。并通過精密度、穩定性、重復性試驗進行方法學考察，結果顯示該方法穩定可靠、重復性好，可用于山羊角藥材的高效液相指紋圖譜研究。

本文首次建立山羊角藥材高效液相指紋圖譜，并指認出4個特征峰，分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷和腺苷。指紋圖譜顯示，10批樣品色譜峰的整體相貌大致相同，都出現了相應的特征性成分峰，大部分藥材指紋圖譜的相似度在0.90以上，安徽合肥、廣東電白、江蘇盱眙藥材的相似度在0.8以上，不同產地的指紋圖譜仍存在一定的差異。共有峰主成分分析結果可知，核苷成分在區分不同產地山羊角藥材中起到重要作用，可作為評價山羊角藥材質量的指標成分。

通過專屬性分析及聚類分析，將山羊角藥材及其偽品進行了有效區分，與山羊角指紋圖譜共有峰相比，各偽品均有未檢測出的共有峰。在聚類分析中偽品與10批山羊角樣品分類距離較大，差異明顯。且不同產地樣品也呈現一定的規律，地理位置越接近的藥材分類距離越小，相似度越高，呈現由南向北依次聚類的規律。說明地理位置是山羊角化學成分形成的重要影響因素。

本方法建立的指紋圖譜可快速地對山羊角偽品與正品進行鑒別和區分，并通過對不同產地的山羊角藥材指紋圖譜進行綜合宏觀分析，為山羊角藥材質量評價及控制提供依據，為山羊角的廣泛應用奠定基礎。

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StudyonHPLCFingerprintofCaprahireusLinnaeus

KANGXinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，QIANDawei2，SUNJiaming1，DUANJinao2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To set u Pthe HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus.Methods：The separation was performed by HPLC.Venusil ASB C18(4.6×250 mm，5 μm)column was used with mixture of 0.1% formic acid-water and acetonitrile as mobile phase in gradient mode.The detection wavelength was 254 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1.Results：The HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus collected from ten different sources was set up.There were ten common peaks，four of witch had been identified by HPLC-DAD-ESI/MS/MS.The fingerprint was analyzed with methods of cluster analysis，principal component analysis and similarity computation.Conclusion：The method is simple，rapid and can be used for identification and evaluation ofCaprahireusLinnaeus.

CaprahireusLinnaeus；HPLC；fingerprints

2014-08-15)

角類動物藥的標準制定項目—國家藥品標準提高暨2015版藥典科研任務(2012)

*

張輝，博士生導師，教授，研究方向：天然藥物化學；E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.010