星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏提取工藝研究△

武婧，宋忠興，古川，劉紅波，翟思程，唐志書*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046；3.陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712046；4.陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 銅川 727031)

·中藥工業(yè)·

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏提取工藝研究△

武婧1,2,3，宋忠興1,4，古川1,2,3，劉紅波1,2,3，翟思程1,2,3，唐志書1,2,3*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046；3.陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712046；4.陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 銅川 727031)

目的：利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏的最佳提取工藝。方法：以鹽酸小檗堿含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法確定黃柏最佳提取工藝。結(jié)果：黃柏的最佳提取工藝為水煎煮提取，液料比8∶1，提取時(shí)間90 min，提取3次，鹽酸小檗堿得率為32.15 mg·g-1。結(jié)論：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏提取工藝，方法簡單合理，且具有良好的預(yù)測(cè)性。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；黃柏；工藝優(yōu)化

黃柏[1]又名關(guān)黃柏、川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃柏具有抗病原微生物、抗?jié)儭⒔祲骸⒖剐穆墒С５茸饔肹2]，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡等功能。黃柏主要有效部位為生物堿類化合物，其中鹽酸小檗堿為其主要有效成分[3]，含量高達(dá)3%以上[4]。

響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過試驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。目前中藥的提取工藝設(shè)計(jì)多采用正交設(shè)計(jì)法，其不能利用較少的試驗(yàn)數(shù)據(jù)找到因素與響應(yīng)值間明確的函數(shù)關(guān)系[5]，以得到最佳的工藝因素組合。響應(yīng)面優(yōu)化法所獲得的信息量大，直觀、預(yù)測(cè)性好。本研究采用響應(yīng)面法，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立多元回歸方程的擬合函數(shù)模型，優(yōu)化黃柏提取工藝，以期為實(shí)際的生產(chǎn)提取工藝提供科學(xué)參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

日立LC-7000A單泵系統(tǒng)液相色譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)；分析天平AL-2049[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；KH-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

黃柏藥材購于西安盛興中藥飲片廠，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤教授鑒定為黃柏的樹皮；鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-200107)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸、十二烷基磺酸鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏中鹽酸小檗堿分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)[6]；檢測(cè)波長：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品5.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取黃柏藥材各50 g，精密稱定，精密吸取不同方法提取的黃柏提取液1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀中，按2.1.1項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積。以鹽酸小檗堿進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=16.964X-0.47，r=0.999 4，表明鹽酸小檗堿在0.4～1.5 μg與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一對(duì)照品溶液在放置0、2、4、8、12、24 h后，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積值，計(jì)算RSD為0.57%。表明供試品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下制備6份供試品溶液，按照2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品，測(cè)定鹽酸小檗堿含量，RSD為0.59%，表明本分析方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 在相同條件下制備6份供試品溶液，分別加50 μg對(duì)照品，按2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品，測(cè)定鹽酸小檗堿含量，平均回收率為97.5%，RSD為0.34%，表明本方法回收率良好。

2.2 單因素考察

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7-12]和預(yù)試驗(yàn)，選擇對(duì)提取工藝影響較大的因素，分別對(duì)提取時(shí)間、提取次數(shù)和液料比進(jìn)行單因素考察。

2.2.1 提取時(shí)間考察 稱取黃柏藥材6份，每份50 g，液料比為10∶1，分別在20、30、45、60、90、120 min提取2次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL。按2.1.1項(xiàng)下條件測(cè)定黃柏提取液中鹽酸小檗堿含量。結(jié)果表明，在20～120 min內(nèi)，提取液中鹽酸小檗堿含量隨提取時(shí)間的增加而增加，但在90～120 min含量增加程度不明顯，故選擇90 min為最佳提取時(shí)間。

2.2.2 料液比考察 稱取黃柏藥材6份，每份50 g，液料比分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，提取時(shí)間為90 min，提取2次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL，按2.1.1項(xiàng)下條件測(cè)定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果表明，提取液中鹽酸小檗堿的含量隨料液比的增大而增大，但當(dāng)液料比大于8∶1時(shí)，提取液中鹽酸小檗堿含量的增幅較小，而且液料比過大，溶劑用量和濃縮工藝的能耗都會(huì)增大，因此選擇8∶1為最佳液料比。

2.2.3 提取次數(shù)考察 取黃柏藥材3份，每份50 g，液料比為8∶1，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)分別為1、2、3次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL，按2.1.1項(xiàng)下條件測(cè)定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果表明，提取液中鹽酸小檗堿含量隨提取次數(shù)的增加而增加。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，提取2次與3次所得的提取液中鹽酸小檗堿的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化與試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以顯著影響黃柏提取效果的3個(gè)因素：提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)為自變量(分別以A、B、C表示)，作變換如下：A=(t-90)/30，B=(z-8)/2，C=(T-2)/1(t、z、T分別為試驗(yàn)提取時(shí)間、液料比及提取次數(shù))，以鹽酸小檗堿得率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行。響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1，其中編號(hào)為13～17的試驗(yàn)為5次重復(fù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)，用來考察模型的誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

用ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)。由表3可知，一次項(xiàng)A

表3 方差分析表

注：***差異極顯著(P<0.000 1)；**差異高度顯著(P<0.001)；*差異顯著(P<0.05)。

從表3的方差分析結(jié)果可知，試驗(yàn)中選用的模型P<0.000 1，說明模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)F值為0.153 9，影響不顯著，說明該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況很好，能較好地起到預(yù)測(cè)作用，在所選試驗(yàn)條件下，各因素對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響顯著(r=0.999 7)。此外，該模型的變異系數(shù)(CV=4.78%)<5%，在可接受范圍內(nèi)。

2.4 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

采用Design-Expert軟件[13]，根據(jù)二次回歸方程繪制相應(yīng)的等高線圖和自變量對(duì)因變量的三維曲面圖，分別將其中一個(gè)因素固定在中心值，以綜合評(píng)分(Y)對(duì)另外兩個(gè)因素描繪三維圖。各因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖1～2。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得如下公式：

2.73-1.48B-0.4C-23.02A=0

公式(1)

0.24-1.48A+0.68C-15.58B=0

公式(2)

1.28-0.4A+0.68B-1.16C=0

公式(3)

聯(lián)立方程組，解得A=0.096 088，B=0.052 445，C=1.057 8，代入前述的變換公式得到提取時(shí)間t=92.882 64，液料比z=8.104 89，提取次數(shù)T=3.057 8，即黃柏的最佳提取工藝條件：提取時(shí)間為92.882 64 min、液料比為8.104 89∶1、提取次數(shù)為3.057 8。但考慮到實(shí)際情況最佳提取工藝條件修正如下：提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次，液料比為8∶1，在此工藝條件下黃柏提取液中鹽酸小檗堿得率為31.7 mg·g-1。

圖1 兩兩交互作用對(duì)鹽酸小檗堿得率影響的等高線

圖2 兩兩交互作用對(duì)鹽酸小檗堿得率影響的響應(yīng)面圖

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按照2.4項(xiàng)下的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)，黃柏提取液中鹽酸小檗堿的實(shí)際平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.15 mg·g-1(預(yù)測(cè)值為31.70 mg·g-1)，RSD為0.2%。試驗(yàn)值與理論值偏差較小，說明本試驗(yàn)中利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化得到數(shù)學(xué)模型可靠，具有良好的預(yù)測(cè)性，所得的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可信，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

本試驗(yàn)通過用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏的提取工藝，建立了影響因素與有效成分提取率間的數(shù)學(xué)模型方程，最終確定了黃柏的最佳提取工藝：提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次，液料比為8∶1。最佳工藝下鹽酸小檗堿的得率為32.15 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值(31.70 mg·g-1)的RSD為0.2%，說明該數(shù)學(xué)模型方程與實(shí)際情況擬合很好，具有良好的預(yù)測(cè)性。因此用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏的提取工藝是可靠的，且合理可行。

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Optimization of Extraction Process of Cortex Phellodendri Chinensis by Central Composite Design-response Surface Methodology

WU Jing1,2,3，SONG Zhongxing1,4，GU Chuan1,2,3，LIU Hongbo1,2,3，ZHAI Sicheng1,2,3，TANG Zhishu1,2,3*

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，Shaanxi，Xianyang712046，China；2.ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；3.ShaanxirheumatismandtumorcenterofTCMengineeringtechnologyresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；4.ShaanxiXingshengdePharmaceuticalCo.，Ltd.，Shaanxi，Tongchuan727031，China)

Objective：To optimize extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology.Methods：Water was chose as the extraction solvent and the effect of three factors such as solvent-solid ratio，extraction time and times was designed by Box-Behnken central composite，taking the content of berberine hydrochloride as evaluation indicator.Extraction process was optimized by central composite design-response surface methodology.Results：The optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis were as follows：ratio of liquid to solid was 8：1，extraction repeated 3 times，90 minutes every time.The yield of berberine hydrochloride under this condition was 32.15 mg·g-1.Conclusion：Optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology is reasonable，simple，and has good predictability.

Central composite design-response surface methodology；Cortex Phellodendri Chinensis；process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.016

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373978)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(2012KCT-20)

*

唐志書，教授，研究方向：中藥高新制備技術(shù)應(yīng)用、中藥資源開發(fā)與綜合利用研究；Tel：(029)38180560，E-mail：tzs6565@163.com