巢湖藍藻酸性多糖的理化性質及其體外抗氧化作用

李志平，張弛，周維清，紀啟芳，孔小衛，李玉成，*

（1.安徽大學資源與環境工程學院，安徽合肥230601；2.安徽大學生命科學學院，安徽合肥230601）

巢湖藍藻酸性多糖的理化性質及其體外抗氧化作用

李志平1，張弛2，周維清2，紀啟芳2，孔小衛2，李玉成1，*

（1.安徽大學資源與環境工程學院，安徽合肥230601；2.安徽大學生命科學學院，安徽合肥230601）

目的：以從巢湖藍藻中分離純化的一種多糖（acidic polysaccharide from Cyanobacteria of Chaohu，CHAP）為研究對象，對其純度、分子質量、光譜特征、單糖組成、抗氧化作用進行研究，旨在為水華藍藻資源進行綜合開發利用提供有價值的參考。方法：采用60℃的熱水抽提藍藻，采用硫酸銨去除其中蛋白質，粗多糖經DEAE-52陰離子交換層析柱分離并用Sephadex G-150進行純化得到純化多糖CHAP。結果：CHAP中多糖和蛋白質含量分別為91.49%和0.18%，紫外-可見光譜表明CHAP不含核酸，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定CHAP的分子質量為2.209×105D，離子色譜（ion chromatography，IC）表明CHAP由6.36%的阿拉伯糖、35.47%的葡萄糖、5.03%的木糖、17.09%的半乳糖、27.36%的甘露糖及一種未知單糖構成。紅外光譜表明CHAP是具有α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰的吡喃糖，CHAP的抗氧化作用表明：CHAP對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基（O2-·）有較強的清除能力，其IC50分別為276μg/mL和186.05μg/mL。CHAP對羥自由基（·OH）的清除能力較弱，清除率不到10%。

巢湖藍藻；酸性多糖；理化性質；抗氧化作用

由于巢湖的富營養化，巢湖每年都會發生嚴重的藍藻水華，微囊藻是形成巢湖藍藻水華的主要種類之一［1］。目前，直接打撈藍藻仍是湖泊富營養化治理的長期基本措施［2］。但是打撈上來的藍藻由于含有藻毒素不能被家禽、家畜直接利用而被隨意堆放在岸邊，此法不但直接占用大量的土地，而且藻體在死亡衰敗過程中產生的有害物質往往會對周邊的環境造成污染［3］。

近年來，藍藻資源化成為了研究熱點之一，許玲等［4］系統介紹了藍藻在能源化利用、提取天然色素、提取藻膽蛋白、提取多糖、生物固氮及其他方面的利用情況，為藍藻的綜合利用提供了有價值的參考。藍藻體內、細胞壁以及由鞘、莢膜、黏質構成的細胞外層都含有豐富的多糖組成［5］，大量研究表明：多糖是一類具有生理生化活性的大分子物質，而且具有抗腫瘤、抗炎癥、提高機體免疫力和降低血糖等生物活性［6］。任欣欣等［7］研究發現：藍藻胞外多糖是一種酸性雜多糖，超過75%的多糖由6種以上單糖組成。胞外多糖具有一系列重要的生理生化功能，而且在生態學和工業上具有廣闊的應用前景。王習達等［8］用熱水浸提法提取、DEAE-52纖維素柱分離純化得到銅綠微囊藻酸性多糖，研究表明銅綠微囊藻酸性多糖是一種新型的α-型吡喃糖，平均分子質量為2.0028×105D，由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成。梅秋紅等［9］采用pH8.0、80℃的熱水抽提銅綠微囊藻，得到兩種胞外多糖，兩種胞外多糖的單糖組成一致，但分子質量不同。這些研究取得了較高的水平，也為當前的研究提供了很好的基礎，但他們往往以實驗室培養的藍藻為研究對象，對野外采集的藍藻的直接研究較少，在理化性質以及活性方面的研究也不足。本實驗以巢湖藍藻為直接提取原料，并對藍藻酸性多糖（acidic polysaccharide from Cyanobacteria of Chaohu，CHAP）進行分離純化，研究其理化性質，探討其體外抗氧化能力，旨在充分利用巢湖藍藻這一大量生物資源，為下一步藍藻多糖在生物活性和藥理藥效等方面的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

2013年7月20日巢湖西半湖塘西河口采集藍藻，經鏡檢98%以上為藍藻門的微囊藻屬，經測定藻漿的含水率為95.85%。

標準單糖葡萄糖（D-glucose，Glc）、半乳糖（D-galactose，Gal）、阿拉伯糖（L-arabinose，Ara）、鼠李糖（L-rhamnose，Rha）、甘露糖（D-mannose，Man）、木糖（D-xylose，Xyl）、標準葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-100、T-500、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Tris美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

DEAE-52陰離子交換層析柱英國Whatman公司；UV-2100分光光度計瑞典Pharmacia Biotech公司；4100型紫外-可見光-近紅外分光光度計日本日立公司；紅外光譜分析儀美國Sigma公司；Waters515高效液相色譜儀美國Waters公司；ICS-3000型色譜儀美國戴安公司。

1.3方法

1.3.1多糖提取與純化

粗多糖的提取：稱取一定量藻漿，反復凍融3次后按1∶30料液比加入蒸餾水混勻，60℃水浴4h，離心取上清液，旋轉濃縮至原體積的1/10，加5倍體積無水乙醇靜置過夜，離心、收集沉淀，加一定量蒸餾水溶解，加固體硫酸銨直至不再溶解為止，離心取上清液，再用透析袋自來水流水透析3d，蒸餾水透析1d，濃縮、冷凍干燥得粗多糖。

藍藻酸性多糖的分離：取一定量粗多糖，溶于適當蒸餾水中。過DEAE-52陰離子交換層析柱，先用蒸餾水洗脫（流速：1.5mL/min，6mL/管），苯酚-硫酸法檢測直至無糖檢測出來為止。然后用1mol/L的NaCl溶液洗脫（流速：1.5mL/min，6mL/管），苯酚-硫酸法檢測直至無糖出來為止。收集合并主峰，鹽洗部分自來水流水和蒸餾水各透析1d，旋轉濃縮、冷凍干燥得酸性藍藻多糖。

藍藻酸性多糖的純化：取20mg酸性藍藻多糖溶于2mL去離子水中，Sephadex G-150層析，以蒸餾水洗脫，流速0.5mL/min，每管2mL。苯酚-硫酸法［10］跟蹤測定多糖并繪制洗脫曲線。收集主峰、冷凍干燥得到藍藻多糖CHAP。

1.3.2CHAP基本理化性質測定

檢驗CHAP在水、乙醇、氯仿等溶劑中的溶解度，并進行斐林試劑反應、硫酸-咔唑反應、碘-碘化鉀反應。

1.3.3CHAP糖含量和蛋白質含量的測定

分別采用苯酚-硫酸法［10］和考馬斯亮藍法［11］測定糖含量和蛋白質含量。

1.3.4CHAP紫外-可見光譜分析

將CHAP用蒸餾水配制成質量濃度為1mg/mL的多糖溶液，用去離子水為空白對照調零，在190～900nm波長范圍內進行掃描。取配制好的多糖溶液與質量分數為6%的苯酚溶液、濃硫酸以1∶2∶5的體積比顯色，混勻靜置10min后在400～900nm波長范圍內進行掃描。

1.3.5CHAP紅外光譜分析

取少量干燥的CHAP與KBr充分研磨制片，然后在4000～500cm-1范圍內掃描，測定其紅外吸收。

1.3.6CHAP分子質量測定［12］

分別稱取10mg的CHAP及多糖標準品Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-100、Dextran T-500、Dextran T-2000分別溶于2mL蒸餾水中，過0.22μm的水膜。分析儀器為高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀，檢測器為蒸發光散射檢測器，分析柱為TSK-GELG4000PWX，柱溫37℃，流動相為乙腈-水（4∶1，V/V），流動相速率為1.0mL/min，上樣量為10μL。分別記錄各自的色譜圖，用分析軟件以標準多糖分子質量的對數值（lgMW）對保留時間tR進行回歸處理，得到回歸方程lgMw= 17.928-1.8712t（R2=0.9932），按照回歸方程求出CHAP分子質量。

1.3.7CHAP單糖組成分析

多糖的水解：精密稱取CHAP樣品25.0mg于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液3mL，充N2后封口，置于110℃烘箱中加熱水解8h，取出70℃旋轉濃縮至干，得多糖水解物。取水解物配制成20mg/L的藍藻水解單糖溶液。

CHAP的離子色譜分析［13］：分別用去離子水稀釋成質量濃度為1.0mg/L的鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖標準溶液，然后再配制質量濃度均為1.0mg/L的上述6種糖的混標溶液。儀器參數：分析儀器為ICS-3000型色譜儀，檢測器為電化學檢測器ED50（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極），掃描電位為脈沖安培電位波形，分析柱為CarboPac PA200（3mm×250mm）。流動相為2.5mmol/L的NaOH，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20μL。

1.3.8CHAP體外抗氧化研究

1.3.8.1對DPPH自由基的清除作用測定

DPPH乙醇溶液呈紫色，在517nm波長處有強烈吸收。加入抗氧化劑后，顏色變淺，溶液吸光度下降，以在517nm波長處吸光度的下降值表示抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力［14-15］。

參考Shimada等［16］的方法，略作改動。準確稱取0.002g DPPH溶于無水乙醇，50mL棕色容量瓶定容。取11支具塞試管（10mL），樣品組試管加入2mL DPPH和2mL一定質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液，混合均勻后，黑暗中反應30min，于517nm波長處測定吸光度。實驗結果重復3次。同時測定抗壞血酸清除DPPH自由基能力，DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：A1為2mL不同質量濃度多糖溶液+ 2mL DPPH溶液即樣品組吸光度；A2為2mL不同質量濃度多糖溶液+2mL無水乙醇即樣品組本身吸光度；A0為2mL去離子水+2mL DPPH溶液即空白組吸光度。

1.3.8.2對羥自由基（·OH）的清除作用測定

利用Fenton反應法產生·OH。·OH氧化水楊酸產生有色物質，該產物在510nm波長處有最大吸光度，吸光度大小與·OH呈正比。在體系中加入含羥基的受試物，受試物上的羥基與Fe2+絡合，從而阻斷·OH的生成途徑［17］。

參考張云俠［12］的方法并略作修改。取11支10mL具塞試管，各加9mmol/L的FeS04溶液1mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，樣品組加入一定質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液2mL，然后加入8.8mmol/L的H2O2溶液2mL啟動反應，室溫下反應1h，在510nm波長出測定吸光度，記錄數據，實驗重復3次。同時測定抗壞血酸清除·OH能力。·OH清除率計算公式如下：式中：A1為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL不同質量濃度多糖溶液+2mL H2O2溶液即樣品組吸光度；A2為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL不同質量濃度多糖溶液+2mL H2O即樣品組本身吸光度；A0為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL H2O+2mL H2O2即空白對照吸光度。

O2-·加速鄰苯三酚的自養化速率并生成有色中間產物，該產物在320nm波長處有強烈的光吸收。如加入產生抑制劑，便能抑制O2-·和有色物質的產生，通過測定吸光度的差異就可判斷出抑制劑的抑制效果［18］。

參考張云俠［12］的方法，并略作修改。取l0mL具塞試管11支，加入5mL濃度為0.05mol/L、pH8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，加入1mL一定質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液，25℃反應20min后，加入3mmol/L的鄰苯三酚0.4mL，混合均勻，25℃準確反應4min后，立即用0.5mL的濃鹽酸終止反應。終止反應后在320nm波長處測定吸光度，記錄數據，實驗結果重復3次，同時測定抗壞血酸清除能力。清除率計算公式如下。

式中：A1為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL不同質量濃度多糖溶液+0.4mL鄰苯三酚溶液+0.5mL濃鹽酸即樣品組吸光度；A2為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL不同質量濃度多糖溶液+0.4mL超純水+0.5mL濃鹽酸即樣品組本身吸光度；A0為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL超純水+0.4mL鄰苯三酚溶液+0.5mL濃鹽酸即空白對照吸光度。

2　結果與分析

2.1多糖的提取與純化

圖1　巢湖藍藻酸性多糖在Sephadex G-150柱上的洗脫曲線Fig.1Elution curve of acidic polysaccharide extracted from Cyanobacteria on Sephadex G-150column

由圖1可知，酸性多糖經Sephadex G-150層析，可以較好地分離兩種多糖，收集后面主峰得到純化多糖（CHAP）。

2.2CHAP理化性質

實驗得到的CHAP為淺棕色疏松絮狀物，易溶于水，不溶于高濃度乙醇及氯仿等有機試劑。碘-碘化鉀反應呈陰性，說明CHAP不是淀粉類多糖。CHAP與斐林試劑和三氯化鐵反應為陰性，說明CHAP不含單糖和多酚類物質。硫酸-咔唑反應呈陽性，說明CHAP含有糖醛酸。

2.3CHAP糖含量和蛋白質含量分析

經測定CHAP中糖與蛋白質含量分別為91.49%和0.18%。

2.4CHAP紫外-可見光譜分析

圖2CHAP紫外-可見光圖譜Fig.2Ultraviolet spectrum of CHAP in the wavelength rang of190-900nm

蛋白質產生紫外吸收光譜的主要原因是色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的側鏈基團對光的吸收，其次是苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）殘基的側鏈基團對光的吸收。Trp和Tyr在280nm波長附近有吸收峰，Phe在257nm波長附近有吸收峰［19］。由圖2可知，CHAP在250～280nm波長范圍無吸收峰，說明CHAP殘留的蛋白質中不含上述氨基酸，同時也說明CHAP不含核酸。由圖3可知，CHAP經苯酚-硫酸顯色反應后，在490nm波長處有多糖的特征吸收峰。

圖3CHAP經苯酚-硫酸法顯色后紫外-可見光圖譜Fig.3UV-visible spectrum of CHAP reacted with phenol and sulfate in the wavelength range of400-900nm

2.5CHAP紅外光譜分析

圖4CHAPP紅外光譜Fig.4IR spectrum of CHAP

由圖4可知，CHAP在3000～2800cm-1、1400～1200cm-1兩組范圍內均有吸收峰，它們屬于糖類的特殊吸收峰，前峰是糖類中—CH2中C—H伸縮振動，后峰是C—H變角振動。在3392cm-1處有一寬峰，代表是多糖中分子間氫鍵O—H引起伸縮振動。1652cm-1處的吸收峰是羰基中的C=O伸縮振動引起的。1411cm-1處的吸收峰則是—COOH中C—O伸縮振動引起的。1035cm-1處的強吸收峰則是吡喃糖環的C—O—C振動引起。894cm-1處的特征峰代表了吡喃環的β端基差向異構的C—H變角振動。在815cm-1處的吸收峰是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰［20］。

2.6CHAP的分子質量

圖5CHAP的HPLC圖HPLCFig.5HPLC of CHAP

由HPLC檢測得到藍藻多糖CHAP基本為單一對稱峰（圖5），說明CHAP純度較高。根據CHAP的出峰時間，計算出CHAP的分子質量為2.209×105D。

2.7CHAP單糖組成分析

離子色譜法是近年來發展起來的色譜分析方法，可通過將糖類物質在強堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進行分離，然后通過金電極脈沖安培檢測器進行檢測，從而達到分析糖類物質的目的［21-22］，該法不需要預先衍生就能檢測到幾乎所有的單糖，且靈敏度高，分析速度快，穩定性較好。

圖6標準單糖離子色譜圖Fig.6Ion chromatogram of monosaccharide standards

圖7CHAP水解樣品離子色譜圖Fig.7Ion chromatogram of CHAP

圖6是標準單糖為L-鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖的標準混合色譜圖。由圖7可知，CHAP的單糖組成是L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖，說明CHAP是一種雜多糖。經計算各單糖百分含量分別為6.36%、17.09%、35.47%、5.03%、27.36%。圖7中位于半乳糖和葡萄糖之間的糖由于缺少標準品的對照，不能鑒定。

2.8藍藻多糖體外抗氧化研究

2.8.1DPPH自由基清除能力

對DPPH自由基的清除能力可以用來衡量抗氧化劑的抗氧化活性，清除率越高，抗氧化能力越強。自由基清除劑對DPPH自由基的清除程度與其所接受的電子數成定量關系，也就是說和抗氧化劑的供氫能力有關［23］。

圖8藍藻多糖和VC對DPPH自由基清除作用的比較Fig.8Comparison of DPPH free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

由圖8可知，VC對DPPH自由基有很強的清除作用，當其質量濃度達到400μg/mL時清除率就接近于100%。在實驗質量濃度范圍內，DPPH自由基清除能力隨著CHAP質量濃度的增加而逐漸升高，但當其質量濃度達到400μg/mL后對DPPH自由基清除能力基本保持不變，最高為60.71%。通過實驗數據求得藍藻多糖對DPPH自由基清除IC50為276μg/mL。VC和CHAP對DPPH自由基清除能力的差異可能與羥基的數目和活性相關［24］。

2.8.2·OH清除能力

·OH是生物體內正常代謝產物，在正常情況下，機體處于動態平衡，一旦平衡被打破，就會對機體造成嚴重損害，從而引起一系列疾病［25］。因此，以對·OH清除率為評價多糖的抗氧化能力具有重要的意義。VC為已知的·OH清除劑，因此以VC為對照品與CHAP進行比較，結果見圖9。VC對·OH的清除能力隨著其質量濃度的升高而升高，CHAP對·OH的清除能力較弱，隨著其質量濃度的變化，清除率無顯著變化，基本維持在7%左右。可能是由于CHAP上的羥基與Fe2+絡合能力較弱，相關的機理還需進一步研究。

圖9藍藻多糖和VC對VC·OH清除作用的比較Fig.9Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

圖1　0藍藻多糖和VC對VC清除作用的比較Fig.10Comparison of superoxide anion free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

3

討論

由于巢湖水體的富營養化沒有根本的改善，每年夏秋季節由于巢湖的富營養化導致的水華爆發對巢湖周邊的生態環境造成了嚴重的災難。而打撈上來的大量藍藻如何有效地利用和處理是目前亟需解決的問題。本實驗以直接打撈的藍藻為原材料，經過反復凍融去除細胞壁［27］，水浴法得到藍藻多糖粗提物。多糖粗提物經過硫酸銨沉淀，在蛋白質沉淀的同時一部分溶解性小的多糖也沉淀下來［28］，這相對于經典的蛋白去除方法Sevag法有處理量大、操作簡便、不產生有害物質等優點，而且多糖可以得到進一步純化。粗多糖經過DEAE-52吸附NaCl洗脫得到酸性多糖，得到的酸性多糖再經過Sephadex G-150純化得到相對均一性多糖CHAP。

從單糖組成上來看，CHAP是酸性雜多糖，這與滇池水華藍藻酸性多糖［29］、太湖水華藍藻酸性多糖［30］研究結論一致。這3種水華藍藻多糖單糖組成中都含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，但單糖組成種類不完全一樣，可能是由于各自不同的環境條件和提取條件導致的。這3種水華藍藻多糖與從實驗室培養的藍藻中提取的酸性多糖［8-9，31］在單糖組成上也不同，而且前者的單糖組成種類明顯多于后者。從分子質量上來看，CHAP的分子質量（2.209×105D）與銅綠微囊藻的胞內多糖分子質量［31］（2.0025×105D）接近，可能是由于胞外多糖的分子質量（7.0012×104D）相對較小，在硫酸銨沉淀環節與蛋白質一起被沉淀下來。初步抗氧化研究表明CHAP對

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Physico-chemical Characteristics and Antioxidant Activity of Acidic Polysaccharide Extracted from Cyanobacteria from Chaohu Lake

LI Zhiping1，ZHANG Chi2，ZHOU Weiqing2，JI Qifang2，KONG Xiaowei2，LI Yucheng1，*
（1.College of Resources and Environmental Engineering，Anhui University，Hefei230601，China；2.College of Life Science，Anhui University，Hefei230601，China）

Objective：To the study physico-chemical characteristics and antioxidant activities of acidic polysaccharide extracted from Cyanobacteria from the Chaohu Lake.Methods：Acidic polysaccharide was extracted by hot water（60℃）from Cyanobacteria.After deproteinization by ammonium sulfate method，the neutral and acidic polysaccharides were pooled from the elutes of DEAE-52gel column.Then，the acidic polysaccharides were further loaded onto Sephadex G-150column and a purified acidic polysaccharide，CHAP，was obtained.HPLC，UV，IR，and IC were used for the analysis of CHAP for purity，molecular weight，monosaccharide composition，spectroscopic characteristics and antioxidant activity.Results：The CHAP obtained contained91.49%polysaccharides and0.18%proteins without the presence of nucleic acids.The mean molecular weight of CHAP was2.209×105D.The monosaccharide composition of CHAP included L-arabinose（6.36%），glucose（35.47%），D （+）xylose（5.03%），D-mannose（27.36%），D-galactose（17.09%），and unknown monosaccharides.Infrared spectrum showed that CHAP was mainly composed of pyranose-polysaccharides and had a characteristic absorption peak ofα-D-galactopyranosyl.The results of antioxidant activity indicated that CHAP had a strong ability to scavenge both superoxide anion free radicals and DPPH free radicals，with IC50values of186.05and276μg/mL，respectively.However，almost no scavenging effect against hydroxyl free radical was observed.

Cyanobacteria from the Chaohu Lake；acidic polysaccharide；physico-chemical characteristics；antioxidant activity

TS244.5

A

1002-6630（2015）05-0007-06

10.7506/spkx1002-6630-201505002

2014-04-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（40972092；41172121）；巢湖入湖重污染河道污染消減關鍵技術與示范工程項目（2012ZX07103-004）

李志平（1987—），男，碩士研究生，研究方向為水污染控制。E-mail：li_zhi_ping@yeah.net

李玉成（1963—），男，教授，博士，研究方向為生物地球化學。E-mail：li-yucheng@163.com