生化糖漿對(duì)藥物致不完全流產(chǎn)早孕大鼠子宮內(nèi)膜血管新生及作用機(jī)制研究

萇鳳錦 梁 杰 彭代銀 陳孟夏 孫學(xué)勤

近年來(lái)，使用藥物終止早期妊娠的人數(shù)逐年增加，但是藥物終止早期妊娠可導(dǎo)致較為嚴(yán)重的后遺癥，即藥物流產(chǎn)后惡露不盡［1］。另外孕婦產(chǎn)后惡露不盡也是臨床中常見(jiàn)的一種婦科疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為藥物流產(chǎn)或者產(chǎn)后惡露不盡是由于子宮內(nèi)瘀血內(nèi)停、妊娠殘留物殘留于子宮內(nèi)，致使子宮內(nèi)膜新生受困，出血時(shí)間延長(zhǎng)［2］。子宮內(nèi)膜的修復(fù)、新生和子宮內(nèi)膜中血管的新生是有著十分緊密的關(guān)系的，子宮內(nèi)膜中血管的順利新生是促進(jìn)子宮內(nèi)膜新生和縮短藥物流產(chǎn)或妊娠后出血時(shí)間的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［3，4］。生化糖漿是由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研究開(kāi)發(fā)的院內(nèi)制劑，是由當(dāng)歸、桃仁、紅花、丹皮、益母草、炒山楂、赤芍、炒蒲黃、川牛膝、川芎、炮姜和炙甘草組成。方中的當(dāng)歸、桃仁、川芎、炮姜、甘草，養(yǎng)血活血、溫經(jīng)化瘀止痛;又加紅花、益母草、丹皮、赤芍以增強(qiáng)其活血逐瘀之力;川牛膝性善下行，活血化瘀，滑胎催產(chǎn)，可活血引瘀下行;炒蒲黃、炒山楂活血化瘀、止血止痛;炒山楂善消肉積，殘留的組織屬血肉瘀滯，故炒山楂可化瘀消滯。因此，本文探究生化糖漿對(duì)藥物致不完全流產(chǎn)早孕大鼠子宮內(nèi)膜的血管新生作用以及其作用的機(jī)制。根據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)指出“瘀血不去，新血不生，祛瘀生新”理論，生化糖漿在對(duì)藥物流產(chǎn)和產(chǎn)后惡露不盡的患者有很好的治療效果［5］，為生化糖漿研發(fā)為新的中藥復(fù)方藥提供依據(jù)，我院對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇40 只健康的SD 雄性大鼠和80只健康的SD 雌性大鼠，其中雄性大鼠體質(zhì)量為250 ～300 g，雌性大鼠的體質(zhì)量為220 ～260 g，大鼠購(gòu)買(mǎi)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購(gòu)買(mǎi)大鼠的許可證號(hào)為SCXK(皖)2014-025。

1.2 藥物和試劑生化糖漿(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào):20140103)，桃紅四物湯(藥材桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地黃、白芍購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，自行煎煮)，米非司酮和米索前列醇(北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào):43140805、43140705)，CD34 兔抗鼠多克隆抗體(Bioworlde 公司，批號(hào):361488)，大鼠促血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2)酶聯(lián)檢測(cè)試劑(美國(guó)RnD 公司，批號(hào):P27831)，酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，Tie-2)兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó)RnD 公司，批號(hào):P27925)。

1.3 主要儀器IX73 型倒置顯微鏡(奧斯巴林IX73)，iMARK 酶標(biāo)儀(BIORAD)，Centrifuge 5417R 型離心機(jī)，病理切片和自動(dòng)包埋機(jī)(德國(guó)徠卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 復(fù)制藥物流產(chǎn)模型［6］將40 只雄性大鼠和80 只雌性大鼠先分開(kāi)喂養(yǎng)1 周，其中雄性大鼠是1 只大鼠1 個(gè)鼠籠進(jìn)行喂養(yǎng)。將雄性大鼠和雌性大鼠在上午8 點(diǎn)按照1 ∶2的比例進(jìn)行合籠，在第2 天清晨5 點(diǎn)進(jìn)行陰栓和陰道圖片檢測(cè)，以發(fā)現(xiàn)陰栓或者陰道圖片內(nèi)有精子時(shí)作為雌鼠受孕的第2 天。在雌鼠受孕后的第7 天的早上8 點(diǎn)灌胃米非司酮，劑量為8.3 mg/kg，晚上18 點(diǎn)灌胃米索前列醇，劑量為100 μg/kg，待灌胃米索前列醇后在大鼠的陰道內(nèi)塞入1 個(gè)大小適中的消毒過(guò)后的醫(yī)用棉球，分別在第2 天的早上8 點(diǎn)和晚上20 點(diǎn)時(shí)取出并檢查棉球上部是否有血跡，如有血跡則判定藥物流產(chǎn)模型復(fù)制成功，反之失敗，模型復(fù)制成功的大鼠共50 只。

1.4.2 大鼠的分組和給藥 將藥物流產(chǎn)模型復(fù)制成功的雌鼠隨機(jī)分為5 組，分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、生化糖漿低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組藥物流產(chǎn)模型雌鼠10 只，另外取10 只正常受孕的雌鼠作為正常對(duì)照組。在模型復(fù)制成功后的第2 天灌胃正常對(duì)照組和模型組大鼠蒸餾水，灌胃陽(yáng)性對(duì)照組大鼠桃紅四物湯，劑量為9.0 g/kg，灌胃生化糖漿低、中、高劑量組大鼠生化糖漿，劑量為5.1、10.2 和20.4 g/kg(按生藥量換算)。每只大鼠灌胃容積為10.0 mL/kg，每天8點(diǎn)進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃各組大鼠1 周，在末次灌胃1 h后處死大鼠并取樣。

1.4.3 藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度(microvessel density，MVD)和Tie-2 檢查 取出各組大鼠的子宮組織，將取出的子宮組織先用生理鹽水沖洗干凈然后在在4%的多聚甲醛內(nèi)固定，再經(jīng)過(guò)石蠟包埋、病理切片、脫蠟、熱修復(fù)、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加CD34和Tie-2 兔抗鼠多克隆抗體，4℃過(guò)夜孵育，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，PBS 返藍(lán)，脫水封片，在倒置纖維鏡下觀察并記錄視野中的MVD，統(tǒng)計(jì)分析Tie-2 的陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度。

1.4.4 藥物流產(chǎn)大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 檢查 腹主動(dòng)脈取血，將各組腹主動(dòng)脈取得的血先靜置一段時(shí)間，然后通過(guò)離心機(jī)進(jìn)行離心，離心條件為3 500 r/min，離心10 min，收集離心后的血清，采用酶聯(lián)吸附免疫法檢測(cè)血清的Ang-1 和Ang-2 的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s 表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)分析采用χ2分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜MVD 的影響模型組大鼠子宮內(nèi)膜MVD 顯著性的小于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜MVD 顯著性的高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1 和圖1。

表1 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜MVD 的影響(±s)

表1 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜MVD 的影響(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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2.2 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠血清中Ang-1 和Ang-2水平的影響模型組大鼠血清中的Ang-1和Ang-2的水平顯著性的小于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 的水平顯著性的高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影響±s，μg/L)

表2 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影響±s，μg/L)

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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2.3 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜中Tie-2 表達(dá)的影響Tie-2 主要特異性表達(dá)與大鼠子宮內(nèi)膜中的腺上皮細(xì)胞中的胞漿內(nèi)，另外在血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中也有少量的陽(yáng)性表達(dá)，Tie-2 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞呈現(xiàn)為棕黃色的顆粒。模型組大鼠子宮內(nèi)膜中的Tie-2陽(yáng)性表達(dá)的積分吸光度顯著性的小于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜中的Tie-2陽(yáng)性表達(dá)的積分吸光度顯著性的高于模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表3 和圖2。

3 討論

產(chǎn)后或者藥物流產(chǎn)后惡露不盡是臨床中十分常見(jiàn)的婦科疾病，中醫(yī)認(rèn)為留血、滯血、舊血、污穢之血等原因所致的血液停滯、血脈不通、瘀結(jié)不散等可以造成血瘀癥，而中醫(yī)認(rèn)為祛瘀才能生新。產(chǎn)后或者藥物流產(chǎn)后惡露不盡主要是由于子宮內(nèi)膜不能得到及時(shí)的修復(fù)，而這一主要原因是由于產(chǎn)后或者藥物流產(chǎn)后機(jī)體的體能下降，氣機(jī)不足，致使子宮內(nèi)膜內(nèi)的血?dú)獬霈F(xiàn)瘀阻，致使子宮內(nèi)膜內(nèi)的血管不能及時(shí)的新生［7，8］。

CD34 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的標(biāo)記物，CD34 特異性的表達(dá)與血管內(nèi)皮中可以作為檢測(cè)各種組織器官中MVD 檢測(cè)的理論依據(jù)［9］。在本研究中藥物流產(chǎn)大鼠模型復(fù)制成功后，大鼠子宮內(nèi)膜中的CD34 的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著性的降低，這表明大鼠經(jīng)過(guò)藥物流產(chǎn)后其子宮內(nèi)膜中的微血管遭到嚴(yán)重的破壞，血管的新生速度顯著降低。而同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組、生化糖漿中劑量和高劑量組中大鼠子宮內(nèi)膜中的CD34 的表達(dá)量顯著性的高于模型組，MVD 的增加量顯著性的高于模型組，這說(shuō)明生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)的血管新生有顯著的促進(jìn)作用。

表3 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜中Tie-2 表達(dá)的影響(±s)

表3 生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜中Tie-2 表達(dá)的影響(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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Ang 是繼血管內(nèi)皮因子之后被發(fā)現(xiàn)的又一種具有較強(qiáng)能力調(diào)節(jié)血管穩(wěn)定和血管新生的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子主要有兩個(gè)亞型，分別為Ang-1 和Ang-2。Ang-1 和Ang-2 參與機(jī)體內(nèi)的多種重要的生理活動(dòng)，如子宮內(nèi)膜血管周期性的變化、胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育等，Ang-1和Ang-2 水平的變化對(duì)女性的生殖功能和正常的生理周期變化有著非常重要的作用［10］。而Ang-1 和Ang-2的共同受體是Tie-2，Ang-1 和Ang-2 在機(jī)體的生命活動(dòng)中并不是直接的參與血管新生和穩(wěn)定的調(diào)節(jié)，而是通過(guò)與Tie-2 受體的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)血管新生和穩(wěn)定的調(diào)節(jié)。當(dāng)Ang-1 和Tie-2 結(jié)合時(shí)，Ang-1 會(huì)使Tie-2 的磷酸化的速度和程度提高，而當(dāng)Tie-2 磷酸化后會(huì)通過(guò)下游的相關(guān)途徑促使新生的血管成熟和穩(wěn)定，這些途徑包括抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移，以達(dá)到血管樹(shù)樣結(jié)構(gòu)的形成，聚集血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。而當(dāng)Ang-2 和Tie-2 結(jié)合時(shí)則會(huì)拮抗Ang-1 和Tie-2 的結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到抑制Tie-2 磷酸的目的，降低Ang-1 對(duì)血管的穩(wěn)定性的作用［11］。而Ang-2 對(duì)血管的調(diào)節(jié)作用是和新生血管周?chē)奈h(huán)境相關(guān)的，當(dāng)微環(huán)境中有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子并且濃度達(dá)到一定水平時(shí)Ang-2 就會(huì)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相互協(xié)同作用促進(jìn)微血管的新生，而當(dāng)微環(huán)境中沒(méi)有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的水平極低時(shí)，則Ang-2 會(huì)抑制血管的新生［12，13］。在本研究中模型組大鼠血清的Ang-1 和Ang-2 及子宮內(nèi)膜中的Tie-2 水平顯著性的低于正常對(duì)照組，而陽(yáng)性對(duì)照組和生化糖漿中、高劑量組大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 及子宮內(nèi)膜中的Tie-2 水平顯著高于模型組，說(shuō)明生化糖漿促進(jìn)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血管新生的作用機(jī)制可能與通過(guò)提高大鼠子宮中的Ang-1、Ang-2 及Tie-2 的表達(dá)水平有關(guān)，以促進(jìn)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜中血管的新生、成熟和穩(wěn)定。

綜上所述，生化糖漿對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜中的血管新生有顯著的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與通過(guò)提高大鼠子宮中的Ang-1、Ang-2 以及Tie-2 的表達(dá)水平有關(guān)。

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