不同年齡女性人群血液中的Dkk-1水平與骨密度相關性的分析研究*

蔣笑，侯大標，吳文銳，馮仕彪，查振剛(暨南大學附屬第一醫院骨關節科，廣東廣州510632)

不同年齡女性人群血液中的Dkk-1水平與骨密度相關性的分析研究*

蔣笑，侯大標，吳文銳，馮仕彪，查振剛△
(暨南大學附屬第一醫院骨關節科，廣東廣州510632)

目的:探討不同年齡女性人群血液中的Dickkopf-1(Dkk-1)水平與骨密度之間的相關性。方法:選取2013年3月～2014年6月在我院行體檢的100例年齡處于20～80歲之間的女性志愿者，按照不同年齡分為青年組(20～39歲)、中年組(40～59歲)和老年組(60～80歲)，從中年女性組中抽取45～55歲25人，分為絕經期女性組和未絕經女性組。采用酶聯免疫吸附法測3組志愿者血清Dkk-1的表達水平，采用雙能X線骨密度測量儀測定3組志愿者全身礦含量，分析不同年齡女性以及絕經與否女性血清Dkk-1水平的差異及Dkk-1水平與骨密度的關系。結果:隨著年齡的增長，人群血清Dkk-1水平相應增高(P＜0.05)，骨密度相應降低(P＜0.05);3組志愿者中，血清Dkk-1水平與骨密度均呈負相關(P＜0.05)。45～55歲年齡范圍內，絕經組女性血清Dkk-1與未絕經婦女相比，Dkk-1水平與骨密度降低的相關性更為密切(P＜0.05)。結論:人體隨著年齡的增加，血清Dkk-1水平會上升，并出現骨密度下降，有發生骨質疏松癥的風險。相同年齡范圍婦女中，絕經后婦女Dkk-1水平表達較高，骨密度降低更明顯，有更大的發生骨質疏松癥危險。Dkk-1表達的增加同時可抑制骨形成和促進骨吸收，有望成為預防和治療骨質疏松癥治療的一個新靶點。

年齡;女性;Dickkopf-1;骨密度

［ABSTRACT］AIM:To conduct the relevance analysis of serum Dickkopf-1(Dkk-1)and bone mineral density (BMD)in the different ages of female populations.METHODS:The women volunteers(n=100，20～80 years old) were selected and divided into young group(20～39 years old)，middle age group(40～59 years old)and elderly group (60～80 years old).The serum levels of Dkk-1 in the 3 groups of volunteerswere detected by ELISA.In themiddle age group，25 people of45～55 years old were selected and divided into postmenopausal group and premenopausal group to detect the serum levelof Dkk-1 in the2 groups of volunteers by ELISA.The BMD wasmeasured by themethod of dual energy X-ray absorptiometry.The differences of Dkk-1 expression levels among different ages of female populations，and the relevance with BMD were compared.RESULTS:With the increase in age，the serum Dkk-1 expression level increased(P＜0.05)，and BMD were reduced(P＜0.05).The blood levelof Dkk-1 and BMD negatively correlated(P＜0.05)in the 3 groups of volunteers.The serum levels of Dkk-1 and BMD had stronger negative correlation in postmenopausalwomen group than that in premenopausal women group.CONCLUSION:With the increase in age，the expression level of serum Dkk-1 increases and the BMD level decreases，which contribute to a risk of osteoporosis.In the same age range，the postmenopausal women express higher level of Dkk-1，and the decreased BMD ismore obvious，which contribute to a greater risk of osteoporosis.The increased level of Dkk-1 also inhibits bone formation and promotes bone resorption.Itmay become a new target for preventing and treating osteoporosis.

［KEY WORDS］Age;Female;Dickkopf-1;Bonemineral density

人體的骨代謝是一個包括成骨和破骨的動態平衡過程，隨著年齡和雌激素的變化，會導致各種信號通路效能的增強或降低，從而使成骨細胞與破骨細胞的增殖分化紊亂，當成骨細胞增殖分化受到抑制而破骨細胞增強的時候，可能會出現骨代謝失衡。骨代謝失衡可導致人體骨密度(bonemineral density，BMD)減少和骨結構異常，進而表現骨質疏松和骨質破壞［1］。近年來，治療骨質疏松癥的分子靶向藥物有了長足的發展。隨著分子靶向藥物的興起，調控骨質平衡的各種通路的研究也不斷深入。分泌型糖蛋白Wnt信號通路與骨形成關系密切，Dickkopf-1 (Dkk-1)是Wnt途徑重要的調控分子，目前研究認為Dkk-1通過阻斷Wnt信號向胞內傳遞，從而使骨形成減少［2］。同時有研究發現Dkk-1可促進破骨細胞分化因子的表達，從而增加破骨細胞數量和活性［3］。因此Dkk-1在人體骨代謝過程中起骨形成抑制作用和骨破壞促進作用。本研究主要通過分析不同年齡女性人群之間血清Dkk-1水平的差異，以及Dkk-1水平與骨密度的相關性，為Dkk-1單克隆抗體應用于治療骨質疏松的臨床試驗提供理論基礎。

材料和方法

1一般資料

選取2013年3月～2014年6月在我院行體檢的女性志愿者100例，年齡20～80歲，平均年齡(54.58±6.39)歲，平均身高(1.61±0.04)m，平均體重(51.26±2.82)kg，平均體重指數為(27.13± 1.26)kg/m2。其中年齡20～39歲34人，設為青年組;年齡40～59歲35人，設為中年組;年齡大于60歲31人，設為老年組。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經我院醫藥倫理委員會審批通過;排除患有心、肝、腎及血液系統疾病者，伴有糖尿病或甲狀腺功能亢進等影響骨代謝的慢性疾病者，體檢前半年內曾使用過激素類或影響骨代謝的其它藥物者。

2研究方法

Dkk-1及骨密度的水平的測定遵循雙盲原則。所有志愿者均于體檢當天清晨抽取空腹肘靜脈血，并于2周后再次抽血，以1 000 r/min速率在4℃條件下離心5 min后分離并提取血清，分裝于EP管后置于－80℃冰箱凍存待用，采用酶聯免疫吸附法檢測血清Dkk-1的濃度，Dkk-1試劑盒購自R＆D，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用雙能X線骨密度測量儀(Hologic.)測量所有志愿者腰L2～4、股骨頸(neck)、股骨大轉子(trochiter)和Ward’s三角區部位的BMD(g/cm2)，最終記錄2次檢測后的平均值。整個測量過程由計算機軟件控制自行定位、測量、處理分析數據并打印數據，重復測定的變異系數為0.5%。

3統計學處理

所有數據經核對證實后均經SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，采用Pearson相關分析方法分析血液Dkk-1水平與骨密度的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1不同年齡女性人群各個部位BMD的差異

3組志愿者的BMD兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，從數據可知，隨著年齡的增長，人體各個部位BMD降低。中年組志愿者各個部位BMD明顯較青年組志愿者降低，老年組志愿者各個部位BMD降低幅度進一步加大，見表1。

表1　不同年齡女性人群各個部位的BMDTable 1.The BMD of different regions of the body in young group，middle age group and elderly group(g/cm2.Mean±SD)

2不同年齡女性人群血清Dkk-1水平的差異

3組志愿者血清Dkk-1的表達兩兩比較均有統計學意義(P＜0.05)，以老年組表達最高，其次為中年組，最低為青年組，隨著年齡的增長，人群血清Dkk-1水平相應增高，見表2。

表2　不同年齡女性人群血清Dkk-1水平Table 2.The serum Dkk-1 level in different ages ofwomen(ng/ L.Mean±SD)

3不同年齡女性人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量(total body bone m ineral content，TBBMC)的相關性

3組志愿者中，血清Dkk-1水平與TBBMC均呈負相關(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in young group，middle age group and elderly group.圖1　不同年齡女性人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量的相關性分析

4相同年齡范圍內絕經和未絕經女性血清Dkk-1水平與TBBMC的相關性

從中年志愿者抽取的45～55歲(n=25)2組志愿者血清Dkk-1水平與TBBMC均呈負相關(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in postmenopausal group and premenopausal group ofmiddle age.圖2　中年組內絕經和未絕經人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量的相關性分析

討論

正常人骨骼系統新陳代謝過程中，破骨細胞的骨吸收作用與成骨細胞的骨形成作用處于動態平衡，這兩者的增殖分化又受到了各種因素如信號通路的調控。因各種因素，如年齡、激素導致信號通路的紊亂，出現破骨細胞的骨吸收作用大于成骨細胞的骨形成作用，則可導致骨量減少，骨密度下降，最終會發展成為骨質疏松癥［4］。骨質疏松癥可導致人體骨質脆性增加，可以導致疼痛，也會大大增加骨折風險，已有多項研究報道，約20%骨質疏松性骨患者骨折后死亡，而將近40%骨質疏松性骨折患者骨折后生活不能自理，嚴重影響患者生活質量［5］。

目前臨床上應用于治療骨質疏松的藥物多種多樣，但除輔助藥物以外更多抑制破骨細胞活性，只有少數藥物增強成骨細胞活性，例如激素類藥物，國內已有學者初步證明雌激素可以同時作用于成骨與破骨細胞，使骨量增加，促進骨折的愈合，但其臨床價值還需要進一步研究［6］。即便是作用于成骨細胞，其藥物的靶點也不相同。隨著骨重塑的分子生物學的不斷發展，調控骨重建的多條信號轉導通路被不斷發現、研究，例如:調控破骨細胞的信號轉導通路有RANKL/RANK信號通路、整合素(integrin)αv、β3信號通路等;調控成骨細胞的信號轉導通路有Wnt/β-catenin信號通路、鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaSR)信號通路、骨形態發生蛋白(bonemorphogenic protein，BMP)信號通路等。隨著信號通路認識的不斷深入，很多專家根據這些信號轉導通路研發了多種新的治療骨質疏松癥的靶向藥物。分子靶向藥物通過信號靶向機制增強成骨細胞的增殖分化，既保證成骨細胞活性也增加成骨細胞的數量，即“保質保量”，所以這類藥物有較大的發掘潛力。值得一提的是，促進成骨細胞功能藥物在抗骨質疏松的同時也能促進骨質疏松并發骨折的愈合［7］。

在調控成骨細胞增殖、分化的信號通路中，研究得較為透徹的是Wnt信號通路，Wnt信號通路在成骨細胞的發育、分化及骨形成作用中起關鍵作用［8］，Dkk-1對Wnt信號通路起負向調控作用［9］。Dkk-1是一種分泌性糖蛋白，可通過與低密度脂蛋白受體5/6(Lrp5/6)和另一類穿膜蛋白Kremen1/2結合形成三聚體，使得細胞外Wnt配體不能與Lrp5/6結合，從而抑制與骨形成相關的Wnt信號轉錄，進而阻斷成骨細胞的分化及骨形成作用，使骨形成減少［10］。

有研究發現，Dkk-1可增加巨噬細胞集落刺激因子等促進破骨細胞分化因子的表達，進而增加破骨細胞數量和活性，促進骨吸收作用，因此Dkk-1表達的增加不僅可抑制成骨細胞的骨形成作用，還可促進破骨細胞的骨吸收作用［11］。已有多項動物模型試驗證實Dkk-1是BMD的調控因子之一［12］。章瑜等［13］通過建立Dkk-1沉默的小鼠U266細胞，研究得出，U266細胞中Dkk-1基因沉默后，其培養上清抑制小鼠前成骨細胞MC3T3-E1成骨分化的能力減弱。從另一個角度證實了Dkk-1對于干細胞向成骨細胞分化的抑制作用。Dkk-1的發現為骨質疏松癥的治療提供新思路，通過制備相關Dkk-1抗體干擾Dkk-1的表達，提高Wnt信號通路的活性，進而促進成骨細胞的骨形成作用從而增加BMD［14］。Dkk-1有望成為骨質疏松治療的一個靶點［15］。大量臨床和基礎實驗研究得出結論，年齡的增長對骨密度產生影響［16］，本研究結果也顯示，隨著年齡的增長，女性群體血清Dkk-1的表達水平升高，而骨密度降低，尤其是老年人群BMD降低更明顯。同時本研究發現，不同年齡女性人群中血清Dkk-1水平與骨密度呈負相關，且年齡越大，兩者相關性越強，表明年齡和血清Dkk-1水平均是骨密度的影響因素。隨著女性群體年齡的增長，尤其是絕經后(一般認為女性絕經時間在45～55歲)，雌激素降低導致骨質保護作用減弱、飲食及活動減少等各方面原因會導致骨密度降低［17］。之前有許多學者通過男性、女性的多角度，對于年齡、Dkk-1和骨密度的關系的研究證實了Dkk-1是導致骨密度下降的重要分子因素［18］。本研究結果不僅提示了年齡與Dkk-1高表達密切相關且導致骨密度降低(相同BMD水平，老年組人群血清Dkk-1水平較中年組和青年組高，提示老年女性人群是骨質疏松癥高危人群)。此外，在相同年齡組(中年組)中，在盡量排除年齡因素后(45～55歲)，未絕經女性Dkk-1表達水平較低，骨密度下降相對緩慢。絕經女性DKK1表達較高，且骨密度下降相對劇烈，即Dkk-1與骨密度下降的相關性更加密切。這也證實了絕經對于女性骨量起到了加劇丟失的作用。因此，對于中老年人，尤其是絕經后高齡婦女，應注意骨質疏松癥的防治，采取各種適合自身的干預措施以減少骨質的吸收和增加骨形成，從而減少或延緩骨質疏松的發生。但目前用于治療骨質疏松癥的Dkk-1抗體的臨床試驗尚未開展。本研究主要在臨床層面分析Dkk-1與骨質疏松癥的相關性，確定Dkk-1為骨質疏松治療的新靶點地位，通過應用Dkk-1單克隆抗體阻斷Dkk-1的表達可能成為骨質疏松癥的治療方法。必須指出的是，Dkk-1抗體仍然要解決特異性的問題，其對骨骼外其它器官的毒副作用是今后研究的關鍵［19］。

綜上所述，人群骨密度受年齡、激素等影響，有可能會導致信號通路的紊亂，如Dkk-1高表達會對Wnt信號造成負向調控。而血清中Dkk-1水平與骨密度呈負相關，這種聯系為骨質疏松癥的預防、診斷和治療提供了新思路，即可通過抑制Dkk-1的表達，促進骨形成，減緩骨量的丟失，這也有望成為骨質疏松治療的一個新靶點。

人體骨骼發育在達到一定的峰值后，骨密度下降是不可避免的，本研究固然是想通過信號通路的靶點，為分子靶向藥物治療骨質疏松癥奠定理論基礎，但也同樣著眼于骨密度下降和骨質疏松癥的預防。對骨質疏松癥研究的目的，不僅僅是為了在嚴重骨質疏松癥的情形下采取被動的應對措施，我們更應該用發展的觀點，將其作為骨密度變化的連續過程來看待。如果在骨密度下降早、中期就能找到相關的調控點，那么對于骨質疏松癥的防治也能起到一定的作用。所以，下一步的研究主要是加大研究人群數量和范圍(尤其是絕經期婦女)，以便進一步了解Dkk-1水平能否作為一個敏感的診斷指標，并通過這個指標，能夠早期預防骨密度的下降，并最終延緩骨質疏松癥的發生和發展。

［1］Zha XY，Pang XN，Li L，et al.Association of osteoporosis(OP)risk stratification and QUS-BMD and DXA-BMD amongmiddle-aged oldmales［J］.Fudan Univ JMed Sci，2014，41(4):504-510.

［2］Boudin E，Fijalkowski I，Piters E，et al.The role of extracellularmodulators of canonical Wnt signaling in bonemetabolism and diseases［J］.Semin Arthritis Rheum，2013，43(2):220-240.

［3］Wang W，Xu J，Liu K，et al.Suppression of Sclerostin and Dickkopf-1 levels in patients with fluorine bone injury［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2013，35(3):402-407.

［4］滕曉英，王連唐.破骨細胞功能調控與骨質疏松癥［J］.中國病理生理雜志，2002，18(8):1012-1015.

［5］Gambacciani M，Levancini M.Management of postmenopausal osteoporosis and the prevention of fractures［J］.Panminerva Med，2014，56(2):115-131.

［6］孫偉，李子榮，胡偵明.雌激素對骨質疏松性骨折愈合過程BMP-4基因表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2005，21(7):1374-1377.

［7］Agholme F，Isaksson H，Li X，etal.Anti-sclerostin antibody and mechanical loading appear to influencemetaphyseal bone independently in rats［J］.Acta Orthop，2011，82(5):628-632.

［8］Liang HD，Yu F，Lv P，et al.Role of sost in Wnt signal pathway in osteoporosis rats and regulating effect of soybean isoflavones on Wnt signal pathway［J］.Mol Biol Rep，2014，41(7):4447-4454.

［9］Colaianni G，BrunettiG，Faienza MF，et al.Osteoporosis and obesity:role of Wnt pathway in human and murine models［J］.World JOrthop，2014，5(3):242-246.

［10］Bafico A，Liu G，Yaniv A，et al.Novel mechanism of Wnt signalling inhibition mediated by Dickkopf-1 interaction with LRP6/Arrow［J］.Nat Cell Biol，2001，3(7): 683-686.

［11］Ahmed SF，Fouda N，Abbas AA.Serum dickkopf-1 level in postmenopausal females:correlation with bone mineral density and serum biochemicalmarkers［J］.JOsteoporos，2013，2013:460210.

［12］Gifre L，Ruiz-GaspàS，Monegal A，et al.Effect of glucocorticoid treatment on Wnt signalling antagonists (sclerostin and Dkk-1)and their relationship with bone turnover［J］.Bone，2013，57(1):272-276.

［13］章瑜，俞康.DKK1基因沉默的人多發性骨髓瘤細胞培養上清對小鼠前成骨細胞成骨分化的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(6):1129-1132.

［14］吳海華，胡永紅.Dickkopf-1在骨質調節中的研究新進展［J］.中華風濕病學雜志，2013，17(3):204-207.

［15］Weng LH，Wang CJ，Ko JY，et al.Control of Dkk-1 ameliorates chondrocyte apoptosis，cartilage destruction，and subchondral bone deterioration in osteoarthritic knees［J］.Arthritis Rheum，2010，62(5):1393-1402.

［16］李毅中，莊華烽，林金礦，等.年齡對股骨頸骨密度和皮質厚度的影響［J］.中國骨質疏松雜志，2012，18(2): 143-145.

［17］Maǐchuk EIu，Voevodina IV，Mitrokhina TV，et al.The risk of atherosclerosis and osteoporosis development in post-ovariectomy syndromewomen during hormone replacement therapy［J］.Ter Arkh，2014，86(8):75-79.

［18］Dovjak P，Dorfer S，F?ger Samwald U，et al.Serum levels of sclerostin and dickkopf-1:effects of age，gender and fracture status［J］.Gerontology，2014，60(6):493-501.

［19］魏巍，陳錦平，張駿，等.骨重塑的分子生物學基礎及骨質疏松癥靶向藥物的研究進展［C］∥浙江省醫學會.2013年浙江省醫學會骨質疏松與骨礦鹽疾病分會學術年會暨國家級骨質疏松癥和骨質疏松性骨折診治進展專題研討會論文匯編.杭州:浙江省科學技術協會，2013:174-179.

Relevance analysis of serum Dkk-1 expression and bonem ineral density in different ages of female populations

JIANG Xiao，HOU Da-biao，WUWen-rui，FENG Shi-biao，ZHA Zhen-gang
(Department of Orthopaedics，First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:263784833 @qq.com)

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.024

1000-4718(2015)05-0906-05

2015-01-15［修回日期］2015-04-28

國家自然科學基金資助項目(No.81472089)

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