Wip1基因沉默對結腸癌細胞化療敏感性的影響

巫翟，夏忠勝，鐘娃，盧錫基，于濤，陳其奎(中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科，廣東廣州510120)

Wip1基因沉默對結腸癌細胞化療敏感性的影響

巫翟，夏忠勝△，鐘娃，盧錫基，于濤，陳其奎
(中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科，廣東廣州510120)

目的:觀察靶向Wip1基因的特異性siRNA序列對結腸癌細胞Wip1基因的抑制效應，探討Wip1基因沉默對結腸癌細胞化療敏感性的影響。方法:將Wip1-811 siRNA轉染入Wip1高表達的RKO結腸癌細胞株，采用real-time PCR法檢測Wip1 mRNA的表達，采用Western blotting方法檢測Wip1蛋白表達，采用MTS方法檢測結腸癌細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期。結果:Wip1-811 siRNA明顯抑制Wip1的表達。抑制Wip1基因表達后，轉染組RKO結腸癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性增加，5-氟尿嘧啶處理組RKO結腸癌細胞活力由(89.4±6.6)%降至(74.7±3.9)%(P＜0.05)，奧沙利鉑處理組細胞活力由(77.9±2.4)%降至(66.7±2.9)% (P＜0.05)。轉染Wip1-811 siRNA后，5-氟尿嘧啶處理組細胞凋亡比例由(7.7±0.5)%升至(12.3±3.2)% (P＜0.05);奧沙利鉑處理組細胞凋亡比例由(14.7±2.1)%升至(34.0±2.1)%(P＜0.05)。結論:沉默Wip1基因表達能增強結腸癌細胞的化療敏感性。

結腸癌;小干擾RNA;Wip1基因;化療敏感性

［ABSTRACT］AIM:To observe the inhibitory effectof siRNA targeting to Wip1 gene on the Wip1 gene expression in the colon cancer cells and to investigate the influence of Wip1 gene silencing on the chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.METHODS:Wip1-811 siRNA targeting to Wip1 genewas transfected into RKO colon cancer cellswith high expression of Wip1 gene.ThemRNA expression ofWip1 wasmeasured by real-time PCR.The protein level of Wip1 was detected by Western blotting.The viability of RKO colon cancer cellswasmeasured by MTSassay.The cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.RESULTS:Wip1-811 siRNA efficiently inhibited the expression of Wip1 at mRNA and protein levels.The enhanced chemotherapy sensitivity of RKO colon cancer cellswas observed after inhibition of Wip1 gene expression.The viability of RKO colon cancer cellswas decreased from(89.4±6.6)%to(74.7±3.9)%after treated with 5-fluorouracil(P＜0.05)and decreased from(77.9±2.4)%to(66.7±2.9)%after treated with oxaliplatin(P＜0.05).The cell apoptotic rate was increased from(7.7±0.5)%to(12.3±3.2)%and from(14.7± 2.1)%to(34.0±2.1)%when RKO colon cancer cells were treated with 5-fluorouracil and oxaliplatin，respectively (P＜0.05).CONCLUSION:Wip1 gene silencing enhances chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.

［KEY WORDS］Colon cancer;Small interfering RNA;Wip1 gene;Chemotherapy sensitivity

結腸癌是消化道常見腫瘤。在中國，近20年來，結腸癌的發病率不斷上升。根據2013年統計資料，結腸癌的發病率已達29/100 000，僅次于肺癌及胃癌;死亡率近14/100 000，位居腫瘤死亡率排名第5位。結腸癌已成為越來越嚴重的影響社會健康的問題。大部分結腸癌患者就診時已發展至中晚期，單純外科治療無法達到理想的治療效果。外科手術后輔以化療可以使結腸癌患者術后總的5年生存率提高10%～15%;對于腫瘤細胞全身轉移無法手術的患者，化療可以延長結腸癌患者的生存時間，并可使部分無法手術切除的病灶變為可手術治療病灶。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奧沙利鉑(oxali-platin)是治療結腸癌最主要的2種一線藥物，基于這2種藥物的FOLFOX化療方案被廣泛采用，但其臨床有效率只有50%，導致治療失敗的原因主要是結腸癌細胞對化療藥物產生了耐藥性。以往的研究采用了各種方法來逆轉結腸癌的耐藥性，包括應用鈣離子拮抗劑、反義寡核苷酸及針對耐藥蛋白的siRNA［1］等，但這些方法療效有限，且一些方法還存在不良反應。因此，仍有待尋找新的措施來逆轉結腸癌細胞的多藥耐藥性。

Wip1是一種原癌基因，其編碼的Wip1蛋白屬于2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族。Wip1是一種單體酶，在2價陽離子(鎂離子、錳離子)的催化下能直接使p53下游蛋白發生去磷酸化而失活，抑制p53介導的細胞DNA損傷修復及受損細胞的誘導凋亡等功能，從而促進腫瘤的發生。本研究通過RNA干擾技術，體外對RKO結腸癌細胞轉染靶向Wip1基因的siRNA，探討轉染靶向Wip1基因的siRNA后，結腸癌細胞對化療藥的敏感性是否增強，從而有望為逆轉結腸癌的耐藥性提供一種新的方法。

材料和方法

1實驗材料

人結腸癌細胞系RKO購自中國科學院上海生命科學研究院;胎牛血清購自BioInd;RPMI-1640培養基購自Gibco;小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)序列Wip1-811 siRNA及陰性對照序列由中國蘇州吉瑪公司合成;Opti-MEM?I無血清培養基和脂質體LipofectamineTM2000購自Life Technologies;RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒和熒光預混試劑SYBR Premix Ex TaqTM(含SYBR Green熒光染料及PCR反應體系底物及酶)購自TaKaRa;PCR擴增引物由Takara合成。BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑Cocktail和Western blotting制膠試劑購自北京康為世紀公司;兔抗人Wip1多克隆抗體購自GeneTex;兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Bioworld Technology;山羊抗兔HRP-IgG購自Earth-Ox;ECL化學發光試劑盒購自Thermo;5-FU和奧沙利鉑化療藥物購自中國大連美侖生物公司;MTS試劑盒購自Promega;流式細胞術實驗用抗體購自BD。

2方法

2.1細胞培養RKO結腸癌細胞株常規培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中生長3 d后傳代1次。取對數生長期細胞，分別按每孔1×104、5×104和2 ×105的標準接種培養于96孔、24孔和6孔板用于實驗。

2.2siRNA的合成及轉染根據NCBI數據庫中Wip1基因序列(NCBI基因序列號8493)和siRNA設計原則，由蘇州吉瑪公司設計合成Wip1特異性siRNA鏈。siRNA序列(Wip1-811 siRNA)、陽性對照(GAPDH)siRNA及陰性對照siRNA序列由蘇州吉瑪公司合成。Wip1-811 siRNA的正義序列為5’-GGGUGGUUCUUGGAAUUCATT-3’，反義序列為5’-UGAAUUCCAAGAACCACCCTT-3’。采用LipofectamineTM2000進行siRNA轉染，取對數生長期的RKO結腸癌細胞接種于24孔板，用不含抗生素的培養液培養24 h至細胞融合度達40%～50%后，棄去上清更換為Opti-MEM?I無血清培養基，Wip1-811 siRNA以50 nmol/L的濃度轉染RKO細胞(轉染率80%)，未做任何處理的細胞設為空白對照(control)組，用LipofectamineTM2000處理的細胞設為脂質體對照(liposome control)組，與人類基因無同源性序列的陰性siRNA序列處理組設為陰性對照(negative control)組，轉染6 h后更換普通培養基。根據是否用相應濃度化療藥物處理，分為非藥物組(non-drug group)及化療藥物組(chemotherapy drug group)。分組后細胞進行如下處理:(1)再培養24 h后提取細胞RNA，采用real-time PCR檢測Wip1 mRNA的表達;(2)再培養48 h后收集細胞蛋白，采用Western blotting檢測Wip1蛋白的表達;(3)再培養24 h后加入5-FU和奧沙利鉑(終濃度均為5μmol/L)處理48 h，MTS檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期。

2.3Real-time PCR采用RNAiso Plus提取細胞總RNA，采用TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA后，用Roche的LightCycler?480 Real-Time PCR擴增儀，于20μL反應體系中加入2μL的cDNA模板，0.4μL 10μmol/L的Wip1上游引物(5’-CAGGGAAACTTTACCAATGAA-3’)，0.4μL 10 μmol/L的Wip1下游引物(5’-ACGAACCAGGGCAGGTATAT-3’)，10μL SYBR Premix Ex TaqTM和7.2 μL的dH2O。采用18S rRNA作為內參照，18S rRNA上游引物為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反應條件為:95℃30 s;95℃5 s，60℃20 s，共40個循環;60℃15 s。Wip1和18S rRNA擴增片段長度分別為180 bp和112 bp。通過PCR擴增儀自帶的基因相對表達量計算程序，計算各組Wip1 mRNA相對表達量，將陰性對照組Wip1 mRNA表達量設為1，通過與陰性對照組相比，比較各實驗組目的基因的表達情況。

2.4Western blotting檢測Wip1蛋白表達生長于6孔板的細胞去培養液，用冷PBS洗2次，每孔細胞加入裂解混合液100μL(91μL RIPA+9μL 10× cocktail)，置于冰上裂解30 min后，細胞刮刮凈板底將裂解液移至干凈EP管，超聲細胞儀碎裂細胞后，14 000×g、4℃離心20min，取上清。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定細胞總蛋白濃度。取40μg細胞蛋白進行SDS-PAGE，5%濃縮膠70 V恒壓電泳至分界線，10%分離膠100 V恒壓電泳至膠底。200 mA 90 min恒流電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，4℃孵育I抗(Wip1 I抗1∶1 000稀釋，GAPDH I抗1∶1 000稀釋)過夜。次日TBST洗膜4次，每次10 min，加入II抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶5 000稀釋)室溫孵育60 min，再用TBST洗膜4次，每次5 min，加入ECL發光液曝光顯影。采用Image-Pro plus 6.0對Western條帶進行灰度分析，Wip1蛋白條帶灰度值除以相應內參條帶灰度值得出各組Wip1蛋白的相對表達量并進行統計學分析。

2.5MTS法檢測細胞活力對數生長期RKO細胞接種于96孔板，每孔細胞數為1×104，培養24 h后將Wip1-811 siRNA轉入細胞并調整siRNA的終濃度為50 nmol/L，繼續培養24 h后加入5-FU及奧沙利鉑(終濃度均為5μmol/L)處理48 h，采用MTS法檢測細胞活力。96孔板每孔細胞(含200μL培養基)加入20μL MTS試劑后，37℃、5%CO2培養箱中孵育3 h，室溫振蕩5 min，在酶標儀上讀取570 nm波長的吸光度(A)值。實驗共分為4組，未做任何處理的細胞設為空白對照組，用LipofectamineTM2000處理的設為脂質體對照組，與人類基因無同源性序列的siRNA序列處理組設為陰性對照組，轉染Wip1-811 siRNA組設為轉染組。其中每一組細胞中未加入化療藥物處理的細胞設為空白對照孔，其細胞活力記為1，通過與空白對照孔比較計算其余加入藥物處理的細胞活力。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期按前文所述處理好各組細胞后，用胰酶將細胞消化、重懸并轉移至流式離心管，PBS洗2次后將細胞分為2管。一管用于檢測細胞凋亡，加入5μL Annexin V及200μL 1×binding buffer緩沖液制成細胞數約1×109/L細胞懸液，避光反應30 min，加入10μL PI上機檢測;另一管用于檢測細胞周期，加入200μL PBS重懸細胞后用2 mL 70%冰凍乙醇固定細胞，次日處理后上機檢測。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組之間計量資料的比較采用t檢驗，多組之間計量資料的比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗或q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1Wip1-811 siRNA抑制結腸癌RKO細胞W ip1 mRNA和蛋白的表達

圖1顯示，空白對照組、脂質體對照組、陰性對照組之間Wip1的mRNA表達無明顯差異，siRNA轉染組Wip1的mRNA表達水平明顯低于另外3組，轉染組與陰性對照組相比，Wip1的mRNA表達量降低約4倍，差異顯著(P＜0.05)。Western blotting結果顯示，siRNA轉染組Wip1蛋白表達水平明顯低于另外3組，進一步灰度分析結果表明，Wip1-811 siRNA組蛋白的相對表達量較陰性對照組降低約4倍，差異顯著(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Influence of Wip1-811 siRNA on the protein expression ofWip1 in RKO colon cancer cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs negative control.圖2　Wip1-811 siRNA對RKO結腸癌細胞W ip1蛋白表達的影響

2Wip1-811 siRNA增強結腸癌RKO細胞對化療藥物的敏感性

表1顯示，轉染Wip1-811 siRNA不能抑制結腸癌RKO細胞的生長(P＞0.05)，空白對照組、脂質體對照組、陰性對照組及siRNA轉染組中5-FU及奧沙利鉑均能明顯降低結腸癌RKO細胞生長活力，差異顯著(P＜0.05);應用化療藥物后，與另外3組對比，轉染組結腸癌RKO細胞生長活力下降更為顯著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表達后結腸癌RKO細胞對化療藥物的敏感性增加。

表1　轉染W ip1-811 siRNA后用抗腫瘤藥處理的RKO結腸癌細胞的活力Table 1.The viability of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean± SD.n=9)

3抑制Wip1基因表達增強化療藥物誘導的細胞凋亡

流式細胞術實驗結果表明，轉染Wip1-811 siRNA對細胞凋亡的影響與對照組相比差異無統計學意義;5-FU及奧沙利鉑能誘導結腸癌RKO細胞凋亡，與對照組相比，差異顯著(P＜0.05);應用化療藥物后，與陰性對照組相比，轉染組凋亡細胞比例明顯上升，差異顯著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表達能增強化療藥物誘導的細胞凋亡，見圖3、4。

4Wip1基因表達水平對細胞周期的影響

流式細胞術細胞周期測定結果表明，轉染Wip1-811 siRNA對細胞周期影響與對照組相比無統計學差異;5-FU阻滯結腸癌RKO細胞于G0/G1期，與對照組相比，G0/G1期細胞比例上升，S期相應降低，差異顯著(P＜0.05);奧沙利鉑將結腸癌RKO細胞阻滯于G2/M期，與對照組相比，G2/M期細胞比例上升，差異顯著(P＜0.05)，沉默Wip1基因表達后，細胞周期比例無明顯改變(P＞0.05)，表明Wip1基因表達不影響5-FU及奧沙利鉑誘導的細胞周期改變，見圖5、6和表2。

討論

p53在眾多的抑癌基因中是最重要的抑癌基因，p53的突變和功能滅活發生于半數以上的人類腫瘤中，完整的p53是阻止癌癥進展的關鍵。Wip1是抑制p53功能的主要因子，目前已經發現Wip1能直接或間接使包括p53、p38 MAPK、ATM、CHK1、CHK2、MDM2和UNG2在內的至少7種靶蛋白去磷酸化［2-3］，引起P53蛋白降解。新研究報道誘導Wip1高表達可以抑制p16基因［4］，導致細胞惡性增殖，Wip1已成為促進腫瘤發生、發展的重要因素。

Figure 3.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+5-FU.圖3　轉染W ip1-811 siRNA對5-氟尿嘧啶誘導的RKO結腸癌細胞凋亡的影響

Figure 4.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+oxaliplatin.圖4　轉染W ip1-811 siRNA對奧沙利鉑誘導的RKO結腸癌細胞凋亡的影響

Figure 5.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.圖5　轉染W ip1-811 siRNA對5-氟尿嘧啶誘導的RKO結腸癌細胞周期的影響

Figure 6.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.圖6　轉染W ip1-811 siRNA對奧沙利鉑誘導的RKO結腸癌細胞周期的影響

結腸癌組織存在Wip1基因高表達，Wip1表達水平與淋巴結轉移、Dukes分級相關，高表達水平Wip1基因提示較差的預后［5］。為進一步明確Wip1在結腸癌中的作用，本研究設計靶向Wip1基因的siRNA并導入RKO結腸癌細胞，轉染后轉染組RKO細胞Wip1 mRNA及蛋白表達均較另外3組明顯降低，證明Wip1-811 siRNA能有效抑制Wip1基因表達。進一步實驗表明，轉染Wip1-811 siRNA對RKO細胞增殖、凋亡及細胞周期無明顯影響，而在應用相同濃度化療藥物的情況下，轉染組RKO細胞的細胞活力明顯低于另外3組，細胞凋亡比例較對照組顯著增加，細胞周期無明顯變化，提示低表達水平的Wip1基因能增強化療藥物的細胞毒作用，抑制Wip1基因表達能增強結腸癌細胞RKO的化療敏感性。本研究證實了Wip1與結腸癌細胞化療敏感性相關，但Wip1在其它結腸癌細胞株中是否表現出相同作用及具體作用機制有待進一步研究。部分研究者認為下調Wip1基因表達可提高p53水平并直接誘導細胞凋亡，基于5-FU和奧沙利鉑方案的結腸癌化療患者，高表達水平的p53可以提高化療成功率，從而延長患者存活時間［6］;抑制Wip1基因能增加野生型P53蛋白的積聚，引起細胞周期蛋白D1表達增加，使S期細胞比例上升，從而提高細胞對化療藥物的敏感性［7］。但本研究結果表明抑制Wip1基因本身不能引起RKO結腸癌細胞凋亡增加及細胞周期改變，仍需要從其它方面探討Wip1影響化療敏感性的可能。有研究認為Wip1基因主要在細胞應對外界刺激如損傷、炎癥、射線及藥物等過程中起作用，通過對磷酸化的p38 MAPK通路去磷酸化導致相關信號通路的失衡，細胞凋亡和細胞周期進程被阻滯，降低藥物治療效果［8］。也有研究認為Wip1是死亡相關蛋白6磷酸化關鍵的負反饋因素之一，高表達Wip1能抑制DNA損傷誘導的死亡相關蛋白6磷酸化，阻止細胞凋亡發生，從而增加細胞對刺激耐受性［9］。沉默Wip1基因可能對腫瘤干細胞自我增殖存在一定抑制作用，從而參與調節腫瘤細胞的化療敏感性［10］。

表2　轉染W ip1-811 siRNA后用抗腫瘤藥處理的RKO結腸癌細胞的細胞周期分析Table 2.The cell cycle analysis of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean±SD.n=6)

本研究采用siRNA瞬時轉染方法成功沉默Wip1基因并證實低表達水平的Wip1增強RKO結腸癌細胞的化療敏感性，為解決結腸癌化療耐藥性提供了新的方法。然而，siRNA瞬時轉染存在基因抑制強度不理想、有效作用持續時間較短等不足之處，對實驗結果的判讀造成一定影響。本研究結果均由體外實驗觀察得到，未來需要構建Wip1-811 siRNA穩定表達載體，在體內外觀察Wip1-811 siRNA長期穩定的RNA干擾效應，并進一步探討Wip1參與調節腫瘤細胞化療敏感性的相關機制。

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Effect of Wip1 gene silencing on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells

WU Di，XIA Zhong-sheng，ZHONGWa，LU Xi-ji，YU Tao，CHEN Qi-kui
(Department of Gastroenterology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail:xiazhsh@163.com)

R543.1;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.016

1000-4718(2015)05-0857-07

2015-02-09［修回日期］2015-04-07

Tel:020-81332598;E-mail:xiazhsh@163.com