STAT1對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖及IFN-β敏感性的影響*

趙嘉璐，孫筱茹，季東翔，陳俊杰，王夢(mèng)怡，蔣磊，李玉蘋(píng)，陳成水△(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州5000;寧波市第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江寧波5000;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州5000)

STAT1對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖及IFN-β敏感性的影響*

趙嘉璐1，孫筱茹1，季東翔1，陳俊杰1，王夢(mèng)怡2，蔣磊3，李玉蘋(píng)1，陳成水1△
(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000;2寧波市第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江寧波315000;3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州325000)

目的:探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖及人重組干擾素β(interferon-β，IFN-β)敏感性的影響。方法:構(gòu)建STAT1基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體Lenti-STAT1，轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)STAT1的細(xì)胞株，EGFP轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。用不同濃度的IFN-β處理各組細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT1、ICAM-1和PCNA的蛋白水平。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)STAT1及對(duì)照EGFP的H1299細(xì)胞株。過(guò)表達(dá)STAT1的H1299細(xì)胞的增殖活性明顯低于EGFP對(duì)照組(P＜0.05)，其對(duì)IFN-β的敏感性顯著高于EGFP對(duì)照組(P＜0.05)。過(guò)表達(dá)STAT1上調(diào)活化的STAT1磷酸化水平，下調(diào)ICAM-1表達(dá)。并且，STAT1增強(qiáng)IFN-β誘導(dǎo)的STAT1磷酸化水平，下調(diào)PCNA表達(dá)。結(jié)論:過(guò)表達(dá)STAT1可抑制H1299細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)IFN-β的敏感性，為STAT1基因聯(lián)合IFN-β治療非小細(xì)胞肺癌提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1;H1299細(xì)胞;干擾素β;肺癌

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effect of signal transducer and activator of transcription 1(STAT 1)on proliferation and interferon-β(IFN-β)sensitivity of human non-small-cell lung cancer H1299 cells.METHODS:STAT1 or EGFP gene was transfected into H1299 cells by the lentiviral vectors system.The cell number was counted under amicroscope and cell proliferation was tested by MTT assay.In addition，the cells transfected with STAT1 and EGFP were treated with IFN-βand cell viability wasmeasured by MTT assay.The protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA were detected by Western blot.RESULTS:Over-expression of STAT1 inhibited H1299 cell proliferation(P＜0.05).H1299 cells transfected with STAT1 gene had a higher sensitivity to IFN-βthan the control cells transfected with EGFP(P＜0.05).Overexpression of STAT1 increased the protein levelof p-STAT1，and reduced IACM-1 expression in H1299 cells.Moreover，STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-β.CONCLUSION:STAT1 inhibits the proliferation and enhances the IFN-βsensitivity of non-small-cell lung cancer H1299 cells.

［KEY WORDS］Signal transducer and activator of transcription 1;H1299 cells;Interferon-β;Lung neoplasms

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已經(jīng)成為第一位的癌癥死因［1］。目前雖然化學(xué)藥物、外科手術(shù)及放射治療方法有了很大的改進(jìn)，但患者5年的生存率仍然低于15%［2］，所以尋找治療肺癌的新方法有著重要意義。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)最重要的功能是參與機(jī)體免疫應(yīng)答和調(diào)控細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化［3-4］。STAT1是STAT家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)可通過(guò)JAK-STAT通路激活STAT1參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、抗病毒和免疫防御［5-6］。Meraz等［7］和Durbin等［8］發(fā)現(xiàn)STAT1基因剔除的小鼠對(duì)任何一種干擾素(interferon，IFN)刺激均無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明STAT1參與了IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。目前，STAT1在肺癌中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究中，我們將STAT1基因轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，及其是否增強(qiáng)IFN-β抗腫瘤作用，并探討可能的機(jī)制，為肺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎239T細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。293T細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，H1299細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2材料

慢病毒載體Lenti-STAT1和Lenti-EGFP已于前期構(gòu)建［9］。人重組IFN-β(R＆D);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、膜封閉液和ECL發(fā)光液(Thermo);鼠抗人ICAM-1單抗和鼠抗人STAT1單抗(BD);兔抗人p-STAT1單抗(CST);鼠抗人PCNA單抗(Abcam);MTT、鼠抗人β-actin單抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(聯(lián)科生物公司)。

3方法

3.1慢病毒載體包裝和轉(zhuǎn)染細(xì)胞將攜帶STAT1基因的慢病毒載體Lenti-STAT1或攜帶EGFP基因的對(duì)照載體Lenti-EGFP與包裝質(zhì)粒PMK-VSVG、PMDL-G/P-RRE、PRSV-REV用CaCl2轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。第2天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集293T細(xì)胞上清液，超速離心，棄上清，用TBS液重懸病毒沉淀。常規(guī)培養(yǎng)的H1299細(xì)胞接種于24孔板中，慢病毒感染細(xì)胞，同時(shí)加入聚凝胺以增加感染效率，48 h后顯微鏡觀察綠色熒光強(qiáng)度。

3.2細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力使用24孔平底的細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔接種細(xì)胞1.5×104個(gè)。分別在1 d、2 d和3 d經(jīng)胰酶消化后置于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性使用96孔平底的細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔接種細(xì)胞3 000個(gè)。分別在1 d、2 d和3 d時(shí)加20μLMTT溶液，4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下選擇波長(zhǎng)450 nm測(cè)定各孔吸光度。根據(jù)各組細(xì)胞的吸光度值繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。將各組細(xì)胞以每孔1 000個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后行藥物干預(yù)。用不同濃度的IFN-β(濃度分為1×104、1× 105和1×106U/L)處理各組細(xì)胞，72 h后處理組和未處理組分別采用MTT法檢測(cè)各組的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn)收集各組細(xì)胞，提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取40μg蛋白樣品經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h后，I抗4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，加II抗室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X光顯影。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)的比較均采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞綠色熒光蛋白和STAT1蛋白的檢測(cè)

慢病毒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染STAT1組H1299細(xì)胞STAT1蛋白過(guò)表達(dá)，見(jiàn)圖1。

2STAT1過(guò)表達(dá)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖及IFN-β敏感性的影響

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞經(jīng)顯微鏡下計(jì)數(shù)后結(jié)果顯示，Lenti-STAT1組細(xì)胞的數(shù)量明顯低于Lenti-EGFP對(duì)照組(P＜0.05)。經(jīng)MTT法檢測(cè)繪制生長(zhǎng)曲線顯示，Lenti-STAT1組細(xì)胞的增殖活性明顯低于lenti-EGFP對(duì)照組(P＜0.05)。各組H1299細(xì)胞用不同濃度的IFN-β處理72h，MTT法檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。Lenti-STAT1組細(xì)胞在各濃度IFN-β處理后，其細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于Lenti-EGFP對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

3STAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同EGFP組細(xì)胞相比，lenti-STAT1組細(xì)胞的p-STAT1(Tyr701)蛋白水平明顯升高，而ICAM-1蛋白水平明顯低于對(duì)照組。在1×106U/L IFN-β干預(yù)72 h后，與EGFP組細(xì)胞相比，Lenti-STAT1組細(xì)胞的p-STAT1蛋白水平明顯升高，PCNA的蛋白量明顯低于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

Figure 1.The expression of green fluorescent protein in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 by immunofluorescence(A，×100)and the protein expression of STAT1 in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 determined by Western blot(B).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖1　慢病毒Lenti-STAT1轉(zhuǎn)染效果及轉(zhuǎn)染后STAT1蛋白的表達(dá)情況

Figure 2.Effects of STAT1 overexpression on the proliferation and IFN-βsensitivity of H1299 cells.A:overexpression of STAT1 inhibited H1299 cell growth;B:overexpression of STAT1 inhibited the proliferation of H1299 cells detected by MTT assay; C:effect of STAT1 overexpression on the sensitivity of H1299 cells to IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖2　STAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞增殖及IFN-β敏感性的影響

討論

JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最常見(jiàn)、最直接的途徑，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)過(guò)程［3］。STAT1是STAT家族第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的成員，通常被認(rèn)為是一種腫瘤抑制蛋白［10］，研究結(jié)果顯示STAT1在乳腺癌、黑素瘤中及白血病扮演抑癌基因的角色［11-13］。STAT1的抑癌作用主要是通過(guò)上調(diào)caspases 2，3和7［14］、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A［15］和IRF1/p53通路的表達(dá)［16］。雖然STAT1作為抑癌基因被逐漸認(rèn)識(shí)，但其在肺癌中的作用尚不明確。

我們課題組前期通過(guò)Western blot檢測(cè)了40例肺癌組織及鄰近肺正常組織中STAT1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示晚期肺癌組織STAT1表達(dá)顯著低于早期肺癌組織［17］，提示STAT1可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。本研究中，我們利用慢病毒表達(dá)載體攜帶STAT1基因［9］轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞，觀察STAT1對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性明顯低于對(duì)照細(xì)胞，STAT1在肺癌中可能作為抑癌基因抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

Figure 3.Effects of STAT1 overexpression on the protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA in H1299 cells.A:overexpression of STAT1 increased the protein level of p-STAT1，reduced the expression of IACM-1;B，C:STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖3　STAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表達(dá)的影響

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)STAT1可以增強(qiáng)IFN-β對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。IFN/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是介導(dǎo)宿主微環(huán)境成分和腫瘤細(xì)胞之間的代表性通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［18-19］，而IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤免疫監(jiān)視則需要STAT1的參與［20］。IFN-β用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤等多種腫瘤的治療并取得了一定的成功［21］，但I(xiàn)FN-β半衰期短，需要提高用藥劑量才會(huì)對(duì)腫瘤產(chǎn)生毒性作用［22］。而一些腫瘤患者對(duì)干擾素治療缺乏反應(yīng)或者耐藥，可能與腫瘤細(xì)胞STAT1缺失相關(guān)。我們的研究結(jié)果也提示過(guò)表達(dá)STAT1能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)干擾素的敏感性，為干擾素聯(lián)合STAT1基因治療肺癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

ICAM-1與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ICAM-1的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增高而增強(qiáng)，與腫瘤的分級(jí)及預(yù)后有關(guān)，可作為判定腫瘤侵襲的指標(biāo)之一［23］。課題組前期研究顯示STAT1在肺癌早期中的表達(dá)明顯高于晚期［17］，而ICAM-1則恰恰相反，這提示我們肺癌組織中STAT1和ICAM-1的表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，STAT1可通過(guò)活化STAT1的磷酸化，下調(diào)ICAM-1的表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。PCNA即增殖細(xì)胞核抗原，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，是反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)［24］。范賢明等［25］用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中的STAT1與PCNA呈明顯負(fù)相關(guān)。在本研究中，我們用IFN-β干預(yù)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)STAT1能增強(qiáng)IFN-β誘導(dǎo)的STAT1磷酸化水平，下調(diào)PCNA的表達(dá)，提高了IFN-β對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

基因治療是疾病治療的有效途徑，而慢病毒載體的研究已成為基因治療的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒表達(dá)載體在人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)STAT1基因，發(fā)現(xiàn)STAT1通過(guò)促進(jìn)STAT1磷酸化水平，抑制ICAM-1表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。同時(shí)過(guò)表達(dá)STAT1增加細(xì)胞對(duì)IFN-β的敏感性，其分子機(jī)制可能主要通過(guò)增強(qiáng)IFN-β誘導(dǎo)的STAT1磷酸化水平。綜上所述，我們的研究為STAT1基因聯(lián)合IFN-β治療肺癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并可能為未來(lái)肺癌的治療提供新的思路。

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Influence of STAT1 on proliferation and IFN-βsensitivity of human nonsmall-cell lung cancer H1299 cells

ZHAO Jia-lu1，SUN Xiao-ru1，JIDong-xiang1，CHEN Jun-jie1，WANG Meng-yi2，JIANG Lei3，LIYu-ping1，CHEN cheng-shui1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Intensive Care Unit，Ningbo No.2 Hospital，Ningbo 315000，China;3Laboratory of Internal Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325000，China.E-mail: chenchengshui@126.com)

R734.2;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.015

1000-4718(2015)05-0852-05

2015-01-05［修回日期］2015-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81400035);溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140052)

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