NF-κB和AP-1對A型流感病毒性心肌炎組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達的調控*

潘海燕，薛陸靜，王逸平，孫花梅，潘閩(南通大學附屬醫院心內科，重癥監護病房，江蘇南通600;杭州市西溪醫院心內科，浙江杭州00;徐州醫學院第二附屬醫院心內科，江蘇徐州006)

NF-κB和AP-1對A型流感病毒性心肌炎組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達的調控*

潘海燕1△，薛陸靜2，王逸平3，孫花梅4，潘閩1
(南通大學附屬醫院1心內科，3重癥監護病房，江蘇南通226001;2杭州市西溪醫院心內科，浙江杭州310023;4徐州醫學院第二附屬醫院心內科，江蘇徐州221006)

目的:探討核因子κB(NF-κB)及激活蛋白1(AP-1)對A型流感病毒(IAV)性心肌炎心肌組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達的調控作用。方法:40只8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為4組:正常對照組經鼻假感染15μL生理鹽水;感染對照組經鼻感染40空斑形成單位(PFU)IAV;NF-κB抑制劑組經鼻感染40 PFU的IAV，腹腔注射吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)10mg/kg，每天1次;AP-1抑制劑組經鼻感染40 PFU的IAV，腹腔注射去甲二氫愈創木酸(NDGA)2.5 mg/kg，每天1次。感染后第9天處死小鼠，切取心臟組織分別進行病理及生化檢查。結果:IAV感染可誘導心肌組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α表達顯著上調，引發心肌急性炎癥反應。PDTC能顯著抑制心肌中NF-κB激活以及異位胰蛋白酶和促炎細胞因子表達上調，有效抑制IAV復制，減輕心肌炎癥反應(P＜0.01)。NDGA能有效抑制AP-1活性(P＜0.01)，輕度抑制促炎細胞因子表達上調(P＜0.05)，但對異位胰蛋白酶表達、IAV復制及心肌炎癥程度無顯著影響(P＞0.05)。結論:IAV感染心肌組織后主要通過激活NF-κB誘導心肌中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達上調，AP-1通路可能僅部分參與了促炎細胞因子的表達調控。

A型流感病毒;病毒性心肌炎;核因子κB;激活蛋白1;胰蛋白酶

［ABSTRACT］AIM:To investigate the regulatory effects of nuclear factor-κB(NF-κB)and activator protein-1 (AP-1)on the expression of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines in influenza A virus(IAV)-induced myocarditis.METHODS:Male BALB/c mice of8 weeks old(n=40)were randomly divided into 4 groups:normal control group (NC)，infection control group(IC)，NF-κB inhibitor group(NI)and AP-1 inhibitor group(AI).Themice in NC group and IC group were instilled intranasally with 15μL saline and 40 plaque forming units(PFU)IAV，respectively.Themice in NIgroup and AIgroup were infected intranasally with 40 PFU IAV and injected intraperitoneally with 10 mg/kg NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)or 2.5 mg/kg AP-1 inhibitor nordihydroguaiaretic acid(NDGA)once daily.Themicewere euthanized at day 9 after instillation，and the heartswere removed for pathological and biochemical analysis.RESULTS:IAV infection induced significant up-regulation of ectopic trypsin，and proinflammatory cytokines interleukin 6 (IL-6)，IL-1βand tumor necrosis factor-α(TNF-α)in themyocardium，and triggered acutemyocarditis.PDTC significantly inhibited NF-κB activation and up-regulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines，and effectively suppressed IAV replication andmyocardial inflammatory response(P＜0.01).NDGA effectively inhibited AP-1 activity(P＜0.01)and mildly suppressed up-regulation of proinflammatory cytokines(P＜0.05)，but had no effects on the expression of ectopic trypsin，IAV replication and the extent ofmyocarditis(P＞0.05).CONCLUSION:IAV infection induces upregulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines inmyocardium predominantly by the activation of NF-κB.AP-1 signaling pathwaymight be only partially involved in the regulation of proinflammatory cytokines.

［KEY WORDS］Influenza A virus;Viralmyocarditis;Nuclear factor-κB;Activator protein-1;Trypsin

病毒性心肌炎是臨床常見疾病，由于A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是人類最常見的感染原，由其引發的心肌炎并不少見，部分心肌炎患者可進展為擴張型心肌病，因此探明其發病機制并進行干預對預防流感病毒性心肌炎具有重要意義。

自然存在的IAV不具有直接入侵細胞的能力，只有當其表面的膜融合糖蛋白血凝素前體(hemagglutinin precursor，HA0)被蛋白酶水解為HA1和HA2后，才能與宿主細胞融合而侵入細胞。胰蛋白酶是一種能夠有效水解HA0的蛋白水解酶，除在胰腺組織表達外，還在心、腦、肺等全身多種器官表達［1］。我們前期研究發現，IAV感染能夠顯著上調心肌組織中的異位胰蛋白酶，被上調的異位胰蛋白酶通過促進流感病毒的感染和復制、誘導細胞因子釋放以及激活基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)等機制觸發心肌急性炎癥反應［1］。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、腫瘤壞死因子受體(tumour necrosis factor receptor，TNFR)、T細胞受體(T-cell receptor，TCR)、B細胞受體(B-cell receptor，BCR)等多種信號通路的關鍵下游，參與調控多種炎癥介質及細胞因子的表達［2-3］。在胰蛋白酶基因的啟動區，有NF-κB和AP-1的結合位點。NF-κB和AP-1是否參與了IAV誘導的心肌異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達上調的調控，目前還不清楚。本研究通過分別抑制NF-κB和AP-1激活，探討NF-κB和AP-1對IAV誘導性心肌炎組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達的調控作用。

材料和方法

1實驗動物及病毒

8周齡雄性BALB/c小鼠40只，SPF級，購自揚州大學比較醫學中心。PR/8/34(H1N1)A型流感病毒，購自ATCC。

2主要試劑

NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)購自上海百靈威化學技術有限公司;AP-1抑制劑去甲二氫愈創木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)購自Sigma;Trizol試劑(上海生工生物工程股份有限公司);cDNA第一鏈合成試劑盒及Taq PCRMaster Mix試劑盒(北京天根生化科技有限公司);RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所);ECL顯影液(CST);兔抗小鼠胰蛋白酶抗體、羊抗小鼠IL-6抗體、兔抗小鼠IL-1β抗體、小鼠抗小鼠TNF-α抗體以及小鼠抗小鼠actin抗體(Santa Cruz);核蛋白提取試劑盒(Pierce);檢測NF-κB及AP-1活性的非放射性凝膠電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)試劑盒(Viagene Biotech)。

3實驗方法

3.1心肌炎模型的建立40只雄性BALB/c小鼠經10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后，按每組10只隨機分為4組:正常對照組經鼻感染15μL無菌生理鹽水;感染對照組經鼻腔感染40空斑形成單位(plaque-forming unit，PFU)IAV(溶于15μL生理鹽水中);PDTC組經鼻腔感染40 PFU IAV，同時每日1次腹腔注射10mg/kg NF-κB抑制劑PDTC;NDGA組經鼻腔感染40 PFU IAV，同時每日1次腹腔注射2.5 mg/kg AP-1抑制劑NDGA。于感染后第9天麻醉處死小鼠，充分灌洗后取出小鼠心臟，用于病理及生化檢測。

3.2RT-PCR使用Trizol試劑提取總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒將2μg RNA逆轉錄合成cDNA。利用Taq PCR Master Mix試劑盒擴增宿主及IAV目標DNA。胰蛋白酶的上游引物為5’-AGTGGGTGGTGTCTGCAGCTCA-3’，下游引物為5’-GAGTCACCCTGGCAGGAATC-3’;IAV非結構蛋白1 (nonstructural protein 1，NS1)的上游引物為5’-CAGCACTCTTGGTCTGGACAT-3’，下游引物為5’-CCGATGAGGACTCCAACTGCAT-3’;β-actin的上游引物為5’-GGACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3’，下游引物5’-GGCCACACGCAGCTCATTGTAGA-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增反應條件為94℃3 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35個循環;72℃5 min。RT-PCR產物由瓊脂糖凝膠電泳分離及溴化乙啶顯影，經凝膠成像系統成像(Bio-Rad)后，利用ImageJ軟件測定條帶的積分吸光度，以β-actin為內參照，分析目標mRNA的相對表達量。

3.3蛋白免疫印跡實驗取100 mg心肌組織至1 mL RIPA裂解液中，利用組織勻漿器提取心肌組織總蛋白并測定蛋白濃度。取等量蛋白經加熱變性后上樣至10%的SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應I抗，4℃過夜，洗膜后分別加入II抗，室溫孵育2 h，再次洗膜。ECL顯影液顯色，曝光成像，利用ImageJ軟件測定積分吸光度，與內參照β-actin的比值作為半定量指標比較目標蛋白的相對表達量。

3.4EMSA實驗100 mg心肌組織剪碎經磷酸鹽緩沖液清洗后，將組織置于試劑盒提供的胞漿提取液中進行勻漿，根據試劑盒說明書，逐次分離胞漿蛋白和提取核蛋白，測定核蛋白濃度。取5μg核蛋白，根據EMSA試劑盒說明書，分別測定核蛋白中NF-κB及AP-1的活性。NF-κB探針序列為5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’，AP-1探針序列為5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’，DNA探針用生物素標記。凝膠電泳后將DNA探針轉移至尼龍膜，紫外線交聯將DNA固定于尼龍膜上，通過化學發光法顯影，曝光成像。利用ImageJ軟件測定積分光密度，所得結果表示轉錄因子與標記探針的結合活性。以正常對照組轉錄因子結合活性為參照，比較各組相對活性變化。

3.5HE染色5μm石蠟切片經脫蠟、水化后，放入蘇木精水溶液中染色，經流水沖洗后再乙醇脫水，然后放入伊紅染色液中染色，再經乙醇脫水后放入二甲苯溶液中使組織透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

3.6心肌組織病理評分心肌組織中有局灶性炎癥浸潤，伴或不伴相關心肌細胞壞死，則判定為心肌炎。根據心肌組織中炎癥細胞的浸潤情況，采用A-bel等［4］提出的0～4分分級法，對心肌炎進行病理評分和半定量分析:0分為無炎癥浸潤;1分為心肌細胞間有小灶性炎癥浸潤，或炎癥細胞包繞單個心肌細胞;2分為炎癥浸潤灶較大，炎癥局灶有100個以上炎癥細胞，或炎癥灶包繞30個以上心肌細胞;3分為10%以上心肌組織切面被炎癥浸潤;4分為30%以上心肌組織切面受累。

4統計學處理

采用SigmaStat 3.5統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1各組小鼠心臟炎性滲出及心肌組織炎癥比較

在感染后第9天，正常對照組心臟表面光滑，無炎性滲出，心肌細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤;感染對照組可見心臟表面有大量炎性滲出，心肌間質內有大量炎癥細胞浸潤，伴局部組織小灶性壞死; PDTC組心臟表面炎性滲出顯著減輕，心肌間質內炎癥細胞也顯著減少;NDGA組心臟表面炎性滲出及心肌內炎癥細胞浸潤較感染對照組有所改善，但不如PDTC組明顯。對小鼠心肌組織炎癥程度進行病理評分，結果顯示，與感染對照組比較，NF-κB抑制劑PDTC能顯著降低感染后第9天小鼠心肌組織病理積分(P＜0.01)，AP-1抑制劑NDGA對小鼠心肌組織病理評分有所改善，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Comparison ofmousemyocardial inflammatory infiltration among different groups.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05 vs PDTC.圖1　各組小鼠心肌炎癥浸潤情況的比較

2各組小鼠心肌組織中NS-1及異位胰蛋白酶表達比較

PCR檢查結果顯示，感染后第9天心肌組織中病毒NS1基因大量復制，胰蛋白酶mRNA表達顯著上調，免疫印跡結果顯示胰蛋白酶原及胰蛋白酶表達顯著上調。PDTC能顯著抑制胰蛋白酶mRNA及蛋白表達，顯著降低NS1 mRNA水平，有效抑制IAV復制(P＜0.01)。NDGA對心肌中異位胰蛋白酶表達及IAV復制無顯著影響(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of viral NS1 and ectopic trypsin in the mouse myocardium among different groups.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲▲P＜0.01 vs PDTC.圖2　各組小鼠心肌組織中NS1及異位胰蛋白酶表達的比較

3各組小鼠心肌組織中促炎細胞因子表達比較

對小鼠心肌中促炎細胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α進行免疫印跡檢測顯示，感染后第9天心肌組織中IL-6、IL-1β及TNF-α表達顯著上調。PDTC及NDGA治療均能顯著抑制IL-6、IL-1β及TNF-α表達上調(P＜0.05或P＜0.01)。但PTDC抑制促炎細胞因子上調的效果顯著強于NDGA(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression of proinflammatory cytokines in the mousemyocardium among different groups.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs PDTC.圖3　各組小鼠心肌組織中促炎細胞因子表達的比較

4各組小鼠心肌組織中NF-κB及AP-1活性比較

EMSA法探針特異性檢測結果顯示，在無核蛋白組未檢測到轉錄因子活性。當核蛋白中加入過量未標記探針后，轉錄因子結合活性被明顯削弱而不能被標記探針測及，提示探針具有特異性。對各組小鼠心肌核蛋白中NF-κB及AP-1的DNA結合活性檢測顯示，正常對照組NF-κB活性較弱，IAV感染后NF-κB活性被顯著上調(P＜0.01)，約為正常對照組7倍。AP-1活性也有所上調(P＜0.01)，約為正常對照組2倍。PDTC能有效抑制NF-κB活性(P＜0.01)，對AP-1活性無明顯影響。NDGA能有效抑制輕度上調的AP-1活性(P＜0.01)，對NF-κB活性無顯著影響，見圖4。

Figure 4.DNA binding activity of NF-κB and AP-1 in themouse myocardial nucleus among different groups.Mean± SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs PDTC.圖4　各組小鼠心肌細胞核中NF-κB及AP-1的DNA結合活性

討論

心肌中異位胰蛋白酶能夠促進IAV感染，觸發急性病毒性心肌炎，抑制胰蛋白酶活性或表達，能夠有效抑制病毒復制，降低促炎細胞因子表達，減輕心肌炎癥反應［1，5］。因此，探明心肌中異位胰蛋白酶及細胞因子的表達調控，對靶向干預胰蛋白酶及細胞因子表達，有效預防IAV感染和減輕心肌炎癥反應具有重要意義。

NF-κB是一種重要的核轉錄因子，常以p50-p65異二聚體的形式與其抑制蛋白IκB結合，以無活性狀態存在于細胞胞漿中［6］。當細胞受刺激后，NF-κB與其抑制蛋白解離而激活，轉入細胞核內，誘導促炎細胞因子、炎癥介質等多種蛋白基因轉錄，參與感染、炎癥、免疫反應及細胞凋亡和分化等病理生理過程。PDTC通過阻斷IκB的從頭磷酸化來抑制IκB降解失活，從而抑制NF-κB的激活，阻止NF-κB活化入核。PDTC作為一種抗氧劑，還可通過清除IAV感染誘導的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、調節氧化/抗氧化平衡來抑制NF-κB激活［7］。此外，PDTC還可通過抑制IAV雙鏈RNA合成以及編譯HA基因的信使RNA合成而發揮抑制IAV復制的作用［7-8］。PDTC能特異性阻斷NF-κB激活，對其它轉錄因子如AP-1、特異性蛋白1(specificity protein 1，Sp-1)等的激活均無影響［9］。

AP-1是細胞內由c-Jun蛋白和c-Fos蛋白家族成員組成的一種重要轉錄因子，可被促分裂素原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶等信號通路活化，調控多種細胞因子以及炎癥介質的表達，被譽為細胞內信號轉導的第3信使。NDGA是一種天然抗氧化劑，廣泛存在于多種含樹脂的植物中。它通過直接干擾fos-jun二聚體與DNA序列結合而抑制fos-jun-DNA復合結構形成，從而阻斷AP-1的基因調控作用。作為抗氧化劑，NDGA是有效的ROS清除劑，還可在基因轉錄過程中，通過限制病毒Sp-1與DNA作用來干擾Sp-1蛋白的反式激活功能而發揮抗病毒作用［10］，NDGA對NF-κB的激活無直接影響［11］。

本研究通過使用PDTC及NDGA分別抑制NF-κB和AP-1的活性，來探明NF-κB和AP-1對心肌中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達的調控作用。由于我們既往研究發現心肌中的異位胰蛋白酶及促炎細胞因子水平在IAV感染后第9天達到高峰，遂于感染后第9天處死小鼠。研究發現，IAV感染后小鼠心肌組織中NF-κB活性顯著上調，PDTC能夠顯著抑制NF-κB激活和心肌中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達上調，抑制IAV在心肌組織中復制，有效減輕心肌炎癥浸潤程度。AP-1活性在IAV感染后第9天也有所上調，但上調幅度不及NF-κB明顯。NDGA能有效抑制IAV誘導的AP-1活性上調，部分抑制促炎細胞因子的表達，其對細胞因子表達的抑制效果不及PDTC顯著，對心肌中異位胰蛋白酶表達及病毒復制無顯著影響。這些結果提示，IAV感染主要通過激活NF-κB信號通路誘導心肌組織中異位胰蛋白酶及促炎細胞因子表達顯著上調。AP-1信號通路僅部分參與了心肌中促炎細胞因子的表達調控，但不參與對心肌中異位胰蛋白酶表達的調控。

在病毒性心肌炎的急性階段，病毒入侵本身、病毒感染直接破壞心肌組織所釋放的損傷物質以及促炎細胞因子等均可誘使炎癥細胞向感染部位聚集，參與急性心肌炎癥反應［12］。本研究發現，NDGA雖能有效抑制AP-1活性，輕度抑制促炎細胞因子表達上調，但對心肌炎癥的改善程度并無統計學意義。我們推測可能與AP-1僅部分參與了IAV感染所誘導的細胞因子表達上調，對胰蛋白酶表達及IAV復制無顯著影響，其抑制劑NDGA輕度抑制促炎細胞因子表達上調所產生的益處尚不足以抵消病毒急性感染所引發的急性心肌損傷有關。

NF-κB及AP-1作為細胞核內重要的轉錄因子，是TLR、TNFR、TCR及BCR等多種細胞信號轉導途徑在細胞核內的匯聚點［2-3］。IAV感染后可激活TLRs(TLR3、TLR7和TLR8)以及維甲酸誘導基因Ⅰ等多種信號通路［13］，引發機體產生一系列病理生理反應。IAV感染后究竟經由哪些通路下傳引發NF-κB及AP-1的激活還不清楚，我們正在深入研究。

目前對病毒性心肌炎的治療除抗病毒及對癥支持處理外，還沒有特別有效的治療措施。本研究發現提示，特異性阻斷NF-κB可能成為預防和治療流感病毒性心肌炎的新策略。

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Regulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokine expression by NF-κB and AP-1 in influenza A virus induced m yocarditis

PAN Hai-yan1，XUE Lu-jing2，WANG Yi-ping3，SUN Hua-mei4，PAN Min1
(1Department of Cardiology，3Intensive Care Unit，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，China;2Department of Cardiology，Xixi Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310023，China;4Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221006，China.E-mail:dr.panhy@gmail.com)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.004

1000-4718(2015)05-0791-06

2014-10-16［修回日期］2015-03-19

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81100154)

Tel:0513-81161301;E-mail:dr.panhy@gmail.com