順鉑不同療程化療對裸鼠人卵巢癌移植瘤的影響

苗 蕊，郭 婧，劉秀萍，張彩虹

卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是致死率最高的婦科惡性疾病［1］。絕大部分卵巢癌患者在確診時已是臨床晚期，70%患者經過手術和化療后腫瘤仍復發，并且呈現化療耐藥［2］。傳統化療一般選擇細胞毒性藥物最大耐受劑量化療，常規為6～8個療程，此種化療方案可以有效控制腫瘤。但也會產生多種不良反應，降低患者的生活質量，并且殘余腫瘤耐藥性更強［2］。本實驗給予荷人卵巢癌裸鼠順鉑(DDP)最大可耐受劑量化療，療程分別為4和8個，觀察不同化療療程對裸鼠皮下移植瘤生長情況及裸鼠體重的影響，分析不同化療療程對腫瘤增長、耐藥及復發的影響并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人卵巢漿液性癌細胞株SKOV3，購自中科院上海細胞庫。接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，置于恒溫37℃、含5%CO2的培養箱中。

1.2 實驗動物 雌性Balb/c裸小鼠24只，6～8周齡，體重16～18 g，由中國軍事醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(軍)2012-0004。在SPF級條件下飼養，所有動物實驗操作過程均遵照國際動物委員會制定的倫理道德規范。

1.3 模型制備及分組 將1×107個SKOV3細胞接種于裸鼠右側大腿皮下建立人卵巢癌異種移植瘤模型。移植瘤體積達150～200 mm3時將24只裸鼠隨機分為對照組、短療程化療組和足療程化療組，每組8只。短療程化療組給予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1個療程，共4個療程;足療程化療組給予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1個療程，共8個療程;對照組給予等量生理鹽水，腹腔注射，每3天1個療程，共8個療程。3組均于療程結束后處死裸鼠取皮下移植瘤組織。

1.4 標本采集 在無菌條件下取出裸鼠皮下移植瘤，移植瘤組織提取總蛋白后保存于－80℃條件下，以備Western blot方法使用。

1.5 主要試劑 Anti-BCRP抗體，購自美國Millipore公司;Anti-LRP1抗體購自美國Abcam公司;Anti-ALDH抗體，購自美國Millipore公司。

1.6 觀察指標 每3天測量裸鼠皮下移植瘤長徑(a)及與其垂直的短徑(b)，根據體積計算公式:V=1/2ab2計算移植瘤體積;每3天稱量裸鼠體重，并觀察移植瘤組織中干細胞標記物和耐藥相關蛋白的表達情況。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，3組及以上比較采用方差分析，組間比較采用LSD法，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 裸鼠皮下移植瘤體積變化 化療前3組裸鼠皮下移植瘤體積和體重比較差異無統計學意義(P＞0.05)，化療過程中3組裸鼠皮下移植瘤均處于不斷增大狀態，化療后3組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，其中短療程化療組和足療程化療組皮下移植瘤體積均小于對照組，且足療程化療組小于短療程化療組(P＜0.01);足療程化療組體重低于對照組及短療程化療組(P＜0.05，P＜0.01)，但短療程化療組裸鼠體重與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組裸鼠化療前后皮下移植瘤體積及體重變化情況(±s)

表1 3組裸鼠化療前后皮下移植瘤體積及體重變化情況(±s)

注:與對照組比較，bP＜0.01;與短療程化療組比較，aP＜0.05，dP＜0.01

體重(g)組別 鼠數 皮下移植瘤體積(mm3)化療前 化療后 化療前 化療后對照組 8 176.00 ±41.58 767.06 ±113.87 21.62 ±0.8520.39 ±2.36短療程化療組 8 187.74 ±55.63 570.68 ±82.45b 20.68 ±2.22 19.50 ±2.85足療程化療組 8 203.10 ±51.51 430.33 ±79.57bd 21.61 ±2.12 17.31 ±1.58ab F＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 0.593 26.308 0.917 3.715 P

2.2 干細胞標記物及耐藥相關蛋白表達水平 3組裸鼠移植瘤組織中 CD133、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)表達水平比較差異有統計學意義(P ＜0.05)。CD133、BCRP、P-gp表達水平足療程化療組高于對照組及短療程化療組(P＜0.01，P＜0.05)，但短療程化療組與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2，圖1。

3 討論

目前卵巢癌的標準一線治療方案是腫瘤細胞減滅術加術后含鉑類藥物最大耐受劑量化療6～8個周期［3-5］。DDP足療程化療可以有效抑制腫瘤生長，但是化療藥物的特異性選擇性不強，一些化療毒性反應如惡心嘔吐、骨髓抑制、毛發脫落等是不可避免的。因此每2個化療周期有1個間歇期，以便正常細胞恢復功能［6］。

Marx［7］認為腫瘤復發及耐藥是由腫瘤細胞中所占比例極小的腫瘤干細胞(CSC)引起的。Baba等［8］首次把 CD133定義為卵巢癌干細胞標記物。Steg等［9］發現，在未化療的原發卵巢癌組織中CD133表達低，化療后CD133表達增加，提示腫瘤干細胞能逃避化療而優先存活并導致腫瘤復發。研究報道，卵巢腫瘤細胞表達CD133是影響預后的一個消極因素［10］。研究發現，卵巢癌組織中表達CD133的患者預后不良，其生存期和無病生存期都較短，腫瘤復發風險更高［10］。有學者認為腫瘤耐藥與ABC轉運蛋白在干細胞高水平表達有關［11］。BCRP、P-gp是ABC轉運蛋白家族，它們可以將化療藥物從細胞中“擠出”，從而影響藥物的吸收和分布，改變藥物的療效和毒性。在耐藥細胞中，BCRP在質膜中占主導優勢［12］，其在質膜上形成二聚體，可以將多種無關物質從細胞中“擠出”。徐志宏等［13］提出BCRP、P-gp表達增強與腫瘤細胞的化療反應性差相關，BCRP的過度表達與腫瘤復發明顯相關，在誘導化療藥物介導的獲得性耐藥方面起很大作用。BCRP過度表達的腫瘤細胞對多種化療藥物呈現出抵抗性。

表2 3組裸鼠移植瘤組織中干細胞標記物及耐藥相關蛋白表達水平(±s)

表2 3組裸鼠移植瘤組織中干細胞標記物及耐藥相關蛋白表達水平(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與短療程化療組比較，dP＜0.01

分組 鼠數CD133 BCRP P-gp對照組8 0.26 ±0.09 0.32 ±0.05 0.30 ±0.00短療程化療組 8 0.33 ±0.08 0.34 ±0.03 0.33 ±0.05足療程化療組 8 0.45 ±0.04bd 0.40 ±0.07ad 0.39 ±0.04bd F 12.423 4.446 9.484 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 3組裸鼠移植瘤中CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平

本研究結果顯示，對照組裸鼠皮下移植瘤體積最大，短療程化療組次之，足療程化療組移植瘤體積最小，但足療程化療組裸鼠體重低于對照組及短療程化療組。足療程化療組CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平高于對照組和短療程化療組，而短療程化療組與對照組之間比較CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平比較差異無統計學意義。提示，與短療程化療比較，足療程化療抑瘤效果較好，且足療程能使殘余瘤組織中具有部分干細胞特性且耐藥相關蛋白高度表達的腫瘤細胞富集，可能使復發腫瘤耐藥性更強，更難治療。

綜上所述，目前常規使用的6～8個療程足量化療抑瘤效果雖較好，但毒性反應重且復發腫瘤耐藥性可能更強。

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