辛伐他汀對慢性阻塞性肺病模型大鼠的治療作用及其機制研究

張立海，史亞楠，李新玲，王麗紅，王雅杰，孫武裝

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續氣流受限為主要特征，支氣管炎、肺氣腫為主要表現的一種慢性疾病［1］。研究顯示，該病與有害顆粒、氣體侵及機體氣道、肺部形成慢性的炎性反應關系密切［2］。據文獻報道，COPD發病率正呈逐年升高態勢［3］。治療方案應以緩解癥狀為主，兼顧對炎性細胞、炎性介質釋放給予有效抑制，最終達到改善生存質量的目的。他汀類藥物能夠對炎性細胞黏附給予選擇性抑制，同時可以降低腫瘤壞死因子(TNF)-α水平、抑制炎性細胞浸潤［4］。本文選取雄性SD大鼠建立COPD模型，旨在探討辛伐他汀治療的作用機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇體質量為160～250 g的雄性健康SD大鼠60只，由河北醫科大學實驗動物中心提供。標準飼料飼養，白晝與夜晚均為12 h，25℃室溫，空氣濕度為50.0% ～60.0%，自由飲水，清潔衛生的飼養環境，保持通風。在實驗前全部大鼠禁食12 h，未限制飲水。

1.2 方法 將SD大鼠60只，隨機分為研究組、模型組、對照組，每組20只，研究組、模型組大鼠第1、15 天，0.3%戊巴比妥鈉溶液麻醉(0.01 ml/g)，氣管插管方式予2 ml脂多糖氣道注入(200 μg)，直立旋轉10～20 s，1次/d。第2～14、16～28天，置于玻璃密閉熏煙箱中，持續吸入香煙煙霧，15支/d，建立COPD模型。14 d后研究組予辛伐他汀(廠家:杭州默沙東制藥有限公司)灌胃(2.5 mg/kg)1次/d，模型組、對照組予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續8周。

1.3 標本獲取 稱重大鼠，10.0%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，切開胸部，暴露氣管及肺部，從心臟取血 5 ml，3500 r/min，離心半徑20 cm，離心10 min，取血清－20℃保存。結扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，以2 ml生理鹽水灌洗左肺，再緩慢回抽，每次回收液體約1.5 ml，如此反復灌洗3次，回收率約75.0%。混勻灌洗液，先取0.5 ml用細胞計數板行支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞計數，余下液體4℃、1000 r/min，離心半徑 20 cm，離心10 min，取上清液－20℃保存。取沉渣涂片，瑞氏染色，按照形態學標準進行細胞分類。將所有大鼠處死同時離取肺部組織，制成切片。

1.4 觀察指標 觀察對比3組BALF細胞總數、分類計數水平，觀察對比3組BALF中白介素(IL)-8、TNF-α 濃度及血清中 IL-8、TNF-α、C 反應蛋白(CRP)濃度。

1.5 統計學處理 選擇SPSS 19.0軟件對數據予以統計處理，其中計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 3組病理形態學表現 模型組與研究組大鼠支氣管管壁及血管周圍均有多種炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，上皮細胞大量脫落，纖毛倒伏、脫落明顯，氣管壁斷裂、增厚明顯，管腔狹窄，肺泡壁變薄，大量融合形成大皰。對照組未發生上述情況，見圖1。

圖1 3組大鼠肺部病理組織比較(HE×400)

2.2 3組BALF細胞總數、分類計數水平對比 3組細胞總數比較，均有明顯差異(P＜0.05)，中性粒細胞、單核－巨噬細胞、淋巴細胞百分比3組也均有明顯差異(P＜0.05)。見表1。

2.3 3組BALF中的IL-8、TNF-α濃度對比 BALF中的IL-8、TNF-α濃度3組相比較，均有明顯差異(P ＜0.05)，見表2。

2.4 3組大鼠血清IL-8、TNF-α、CRP濃度對比 3組血清IL-8、TNF-α、CRP濃度相比較，均有明顯差異(P ＜0.05)，見表3。

表1 3組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、分類計數水平比較(±s)

表1 3組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、分類計數水平比較(±s)

注:研究組、模型組大鼠建立COPD模型，2周后研究組予辛伐他汀灌胃，模型組、對照組予生理鹽水灌胃

組別 例 細胞總數(108/L) 中性粒細胞(%) 單核－巨噬細胞(%) 淋巴細胞(%)研究組 20 3.62 ±0.28 25.76 ±2.93 62.87 ±3.26 11.27 ±1.58模型組 20 7.85 ±0.27 29.17 ±4.08 55.53 ±4.41 15.19 ±5.13對照組 20 1.57 ±0.18 11.69 ±2.25 79.25 ±2.86 9.04 ±1.87 F 4.172 4.336 5.129 4.131 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 3組大鼠肺泡灌洗液的白介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α濃度對比(±s)

表2 3組大鼠肺泡灌洗液的白介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α濃度對比(±s)

注:研究組、模型組大鼠建立COPD模型，2周后研究組予辛伐他汀灌胃，模型組、對照組予生理鹽水灌胃

組別 例 IL-8(pg/ml) TNF-α(pg/ml)研究組20 20.66 ±1.49 28.64 ±1.79模型組 20 24.93 ±2.83 34.85 ±4.21對照組 20 16.15 ±2.12 21.97 ±3.64 F 4.614 5.228 P ＜0.05 ＜0.05

表3 3組大鼠血清白介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、C反應蛋白(CRP)濃度比較(±s)

表3 3組大鼠血清白介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、C反應蛋白(CRP)濃度比較(±s)

注:研究組、模型組大鼠建立COPD模型，2周后研究組予辛伐他汀灌胃，模型組、對照組予生理鹽水灌胃

組別 例 IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)CRP(mg/L)研究組20 22.73 ±3.17 12.34 ±0.62 1.49 ±0.17模型組 20 30.51 ±3.36 12.85 ±0.83 1.74 ±0.22對照組 20 16.78 ±1.58 9.22 ±0.53 1.14 ±0.26 F 4.175 4.683 5.119 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

COPD早期的造模方法是單純煙熏，煙熏是誘發COPD動物模型的必要條件，大量吸煙和反復呼吸系統感染是人類COPD形成的重要病因［5］。香煙煙霧中含有的焦油、尼古丁、丙烯醛、氫氰酸、過氧化物等化學物質能損壞氣道纖毛上皮細胞及肺泡上皮細胞等，使得纖毛脫落，運動及防御能力下降，上皮細胞及肺泡細胞增生、化生和壞死［6］，煙霧中的氧自由基能活化中性粒細胞和肺泡巨噬細胞生成更多的氧自由基，循環加劇［7］。同時煙霧可使氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞的通透性增加，造成抗胰蛋白酶系統失衡，導致肺氣腫形成，并增加肺部感染概率［8］。當肺部受革蘭陰性細菌感染后，機體免疫系統被激活，細菌裂解胞膜釋放脂多糖，可直接造成上皮細胞的損傷，進一步加重肺部炎癥［9］。

研究顯示［10］，通過煙熏和氣管內注入脂多糖的方法模擬COPD的主要致病因素，可造成COPD大鼠模型。本實驗COPD模型組大鼠支氣管管壁及血管周圍均有多種炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，上皮細胞大量脫落，纖毛倒伏、脫落明顯，氣管壁斷裂、增厚明顯，管腔狹窄，肺泡壁變薄，大量融合形成大皰等典型COPD病理學特征［11］。以上從病理形態學證明了該法制備 COPD模型的可行性［12］。COPD的氣道炎癥以淋巴細胞、肺泡巨噬細胞和中性粒細胞浸潤為主，被激活的炎性細胞可釋放許多炎性介質及細胞因子，直接參與COPD氣道炎癥的進展［13］。IL-8能夠趨化、活化白細胞，抑制中性粒細胞凋亡，延長中性粒細胞壽命，對COPD的氣道炎癥起著引發、維持、甚至加重的重要作用［14］。TNF-α僅可以增強白細胞對損傷的免疫反應，以自分泌形式作用于單核巨噬細胞使其釋放各種炎性介質，增加對病原體的吞噬和消化，并促進炎性細胞因子的釋放，但同時也擴大了炎性反應，引起組織損傷［14］。本文觀察發現，3組細胞總數比較，均呈明顯差異，中性粒細胞、單核－巨噬細胞、淋巴細胞百分比3組比較，也均呈明顯差異，這說明COPD大鼠應用辛伐他汀治療，對炎性細胞水平具有顯著降低的作用。

3組BALF中的IL-8、TNF-α濃度比較，均呈明顯差異，以及血清 IL-8、TNF-α、CRP濃度也均呈明顯差異。由于他汀類藥物可選擇性抑制炎性細胞的黏附，并明顯抑制炎性細胞的浸潤，通過減少TNF-α等細胞因子的分泌來減輕炎癥反應［15］。研究顯示通過觀察大量COPD肺功能的資料發現，使用過他汀類藥物的患者肺功能比未使用過的患者有明顯的改善，充分證明了他汀類藥物可緩解肺功能下降程度［13］。另據文獻報道［14］，使用他汀類藥物可以降低COPD患者的發病率和死亡率，而且還具有抗氧化、抗金屬蛋白酶、抗炎癥介質、抗炎性細胞因子、降低CRP的作用。

綜上所述，COPD大鼠應用辛伐他汀治療，通過使BALF、血清中的炎癥因子降低，減輕氣道、肺組織炎癥，從而達到治療目的。

［1］李玉屏，羅百靈，張立，等.白藜蘆醇減輕慢性阻塞性肺疾病大鼠內質網應激誘導的肺泡上皮細胞凋亡研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2014，37(1):30-35.

［2］李渺苗，辛曉峰，邵宏濤，等.神經生長因子及其酪氨酸激酶A受體在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞中的表達［J］.中華結核和呼吸雜志，2012，35(8):601-605.

［3］袁浩，羅百靈，何白梅.紅霉素對慢性阻塞性肺疾病大鼠轉化生長因子-β1和分泌型白細胞蛋白酶抑制劑表達水平的影響［J］.中華結核和呼吸雜志，2011，34(7):523-527.

［4］李澤庚，王傳博，方莉，等.中華中醫藥學會2013年學術年會論文集［C］.北京［出版者不詳］，2013.

［5］龍翔，宋衛東，劉媛媛，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺樹突細胞數量及成熟度變化與慢性炎癥的關系［J］.中華結核和呼吸雜志，2011，34(8):609-613.

［6］胡亦新，范利，崔華，等.阿托伐他汀對老年慢性阻塞性肺病大鼠心肌和血管損傷的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2010，12(4):351-354.

［7］江德鵬，李琪，維克多·克羅索夫，等.攜分泌型白細胞蛋白酶抑制因子的間充質干細胞對慢性阻塞性肺疾病大鼠的治療作用［J］.中華醫學雜志，2011，91(48):3438-3441.

［8］何白梅，羅百靈，彭振宇，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的肺組織內質網應激與細胞凋亡［J］.中華結核和呼吸雜志，2011，34(5):375-379.

［9］馬碧蔓，劉朝暉，梁志科，等.蛋白酶體抑制劑MG-132抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型膈肌萎縮的研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2013，36(6):441-446.

［10］崔金霞，張永東，時瑩慶，等.高海拔COPD大鼠血漿TNF-α、IL-6和 IL-10水平升高［J］.基礎醫學與臨床，2014，34(8):1108-1109.

［11］許森赫，孫連坤，范麗雯，等.P38抑制劑CDS1124對大鼠COPD的干預作用［J］.中國實驗診斷學，2014(6):883-885.

［12］尚立芝，謝文英，張良芝，等.愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠白三烯B4、白細胞介素-6及肺組織病理形態的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20(12):170-173.

［13］謝文英，尚立芝，潘曉麗，等.愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能、血氣指標及病理變化的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20(22):117-122.

［14］鄺少松，嚴家榮，鐘志勇，等.克咳片對老年大鼠慢性阻塞性肺疾病的治療作用［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2014，28(1):29-34.

［15］韓婧，張朝杰，張程，等.甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫大鼠肺泡隔細胞凋亡的影響［J］.中國生化藥物雜志，2014(4):36-39.