提高八味痛經膠囊質量標準的研究

周建華等

[摘要] 目的 建立八味痛經膠囊的質量控制標準。 方法 采用TLC法對八味痛經膠囊中當歸、桂枝、牡丹皮、延胡索進行鑒別，用HPLC法測定八味痛經膠囊中的牡丹皮和白芍共同有效成分芍藥苷的含量。 結果 薄層色譜可鑒別出當歸、桂枝、牡丹皮、延胡索的特征斑點，且陰性對照無干擾；HPLC法測定芍藥苷0.2575～2.5750μg線性關系良好，平均加樣回收率為98.98%，RSD=1.0%（n=6）。 結論 該方法簡便可靠，專屬性強，重現性好，可用于八味痛經膠囊的質量控制。

[關鍵詞] 八味痛經膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；芍藥苷；質量標準

[中圖分類號] R286 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）13-28-05

[Abstract] Objective To establish quality standard for Baweitongjing Capsules. Methods Angelicae sinensis Radix， Cinnamomi Ramulus， Moutan Cortex， Corydalis Rhizoma were identified by TLC， and the content of Paeoniflorin in Moutan Cortex and Paeoniae Alba Radix was determined by HPLC. Results TLC could identify Angelicae sinensis Radix， Cinnamomi Ramulus， Moutan Cortex， Corydalis Rhizoma. Paeoniflorin showed a good linear relationship at a range of 0.2575-2.5750μg. The average recovery was 98.98%（n=6） and RSD was 1.0%. Conclusion The method is simple， accurate， high specificity， and with good repeatability. The method can be used for Baweitongjing Capsules quality control.

[Key words] Baweitongjing capsules； TLC； HPLC； Paeoniflorin； Quality standard

八味痛經膠囊由牡丹皮、白芍、川牛膝等八味中藥組成，是根據《國家中成藥標準匯編·中成藥地方標準上升國家標準部分》外科、婦科分冊收載的八味痛經片[1]，經劑型改革研制而成。具有活血調經，化瘀止痛的功效，用于經行不暢，色紫成塊，行經腹痛。為提供該藥品可行的質量標準，我們對其開展了試驗研究，采用薄層色譜法對八味痛經膠囊中當歸、桂枝、牡丹皮、延胡索進行鑒別；牡丹皮、白芍為處方中主要藥味，芍藥苷是其共同的有效活性成分，具有抗自由基損傷，抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性，體內實驗證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環、抗氧化、抗驚厥等多種生物學效應，并且毒副作用較小[2]。目前報道芍藥苷的含量測定方法多為高效液相色譜法[3-13]，通過試驗摸索和方法學研究，建立了HPLC法測定該制劑中芍藥苷的含量，提高了該制劑的質量控制標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2996高效液相色譜儀；Waters 2996 PDA檢測器；Empower數據工作站。WD-9403C型紫外分析儀（北京市六一儀器廠），BYCDE-939薄層自動鋪板器（重慶南岸貝爾德儀器技術廠），KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），定量毛細管（美國Drummond公司），BP211D電子天平（Sartorius）。

1.2 試藥

當歸對照藥材、桂皮醛、丹皮酚、延胡索乙素等對照品，均購自中國藥品生物制品檢定所。八味痛經膠囊（規格：0.31g/粒，江西汪氏藥業有限公司，批號080107、080108、080109、080128、080129、080130），芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110736-200423）。甲醇、乙腈均為色譜純，乙醚、丙酮等試劑均為分析純，實驗用水為超純水。硅膠G（薄層色譜用，青島海洋化工有限公司）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當歸的鑒別 取本品內容物6g，研細，加乙醚20mL，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液揮至1mL作為供試品溶液。另取當歸對照藥材0.5g，加乙醚20mL，同供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。同時制備陰性對照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項規定制成缺當歸的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，置展開劑預飽和10min的展開缸內，展開約10cm，取出晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.1.2 桂枝的鑒別 取桂皮醛對照品，加乙醇適量制成每1mL含桂皮醛1μL的溶液作為對照品溶液。同時制備陰性對照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項規定制成缺桂枝的陰性樣品，再按2.1.1項下的供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取2.1.1項下的供試品溶液以及上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，置展開劑預飽和10min的展開缸內，展開約13cm，取出晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，置日光下檢視。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖2。

2.1.3 牡丹皮的鑒別 取丹皮酚對照品，加丙酮適量制成每1mL含丹皮酚1mg的溶液作為對照品溶液。同時制備陰性對照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項規定制成缺牡丹皮的陰性樣品，再按2.1.1項下的供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取2.1.1項下的供試品溶液以及上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶2∶1）為展開劑，置展開劑預飽和10min的展開缸內，展開約10cm，取出晾干，噴以鹽酸酸性5%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。

2.1.4 延胡索的鑒別 取本品內容物3g，研細，加甲醇20mL，超聲處理20min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL使溶解，加氨試液調節pH值至9，用乙醚萃取3次，每次10mL，合并乙醚萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解作為供試品溶液。另取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1mL含延胡索乙素1mg的溶液作為對照品溶液。同時制備陰性對照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項規定制成缺延胡索的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各5μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正己烷∶三氯甲烷∶甲醇（15∶8∶2）為展開劑，置展開劑預飽和10min的展開缸內，展開約11cm，取出晾干，置碘缸中熏至斑點顯色清晰，取出在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 采用Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相A（乙腈）、流動相B（0.1%磷酸溶液）按表1進行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為230nm；進樣量為20μL。理論板數以芍藥苷峰計不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品10.3mg，置100mL量瓶中，加稀乙醇適量使溶解

并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液。精密量取對照品母液5mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內容物，研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞稱重，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱重，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按照處方中各藥味的比例和制法項規定制成缺牡丹皮和白芍的陰性樣品，再按2.2.3項下的供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.5 線性關系考察 精密吸取2.2.2項下的對照品母液2.5、5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以芍藥苷進樣量x（μg）為橫坐標，以峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程y=1331863x-17482.93，r=0.9999。表明芍藥苷進樣量與峰面積在0.2575～2.5750μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定其峰面積，RSD為0.7%。

2.2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8h進樣，按上述色譜條件測定，峰面積的RSD為0.5%，說明八味痛經膠囊供試品溶液中芍藥苷在8h內均穩定。

2.2.8 重復性試驗 取同一批號八味痛經膠囊樣品（批號080107），按2.2.3項下的供試品溶液處理方法制備6份供試品溶液，進行測定，計算含量，結果平均含量為3.0573mg/g，RSD為0.1%。

2.2.9 回收率試驗 取已知含量的八味痛經膠囊樣品（批號080107）6份，每份取樣0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入芍藥苷對照品溶液（0.0309mg/mL）25mL，密塞稱重，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱重，用稀乙醇

3 討論

取芍藥苷對照品溶液，注入液相色譜儀，選取二極管陣列檢測器在210～400nm范圍內進行全波長掃描，測定芍藥苷在230.8nm波長處有一較大吸收，參照中國藥典（一部）白芍藥材項下規定[14]，選擇230nm作為本實驗檢測波長。

曾考察過I.甲醇∶水（25∶75），II.乙腈∶0.1%磷酸溶液（15∶85），III.乙腈∶0.1%磷酸溶液（17∶83）這三種流動相，但以乙腈∶0.1%磷酸溶液（17∶83）為流動相，芍藥苷峰基線完全分離，對稱性好，分析時間適中，但芍藥苷峰后較長時間處有2～3個小峰，為了避免影響后面進樣中芍藥苷峰，在芍藥苷峰采集完后采用梯度洗脫趕掉小峰，經試驗摸索，按本文中的色譜條件梯度洗脫較佳。

試驗中對供試品溶液提取方法、提取溶劑、溶劑用量和提取時間分別進行了考察，提取方法考察了加熱回流法和超聲提取法，結果表明超聲提取法較加熱回流法提取更完全，且操作方便，故選擇超聲提取法；提取溶劑考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇四種溶劑，結果表明稀乙醇較其他溶劑提取更完全，故選擇稀乙醇作為提取溶劑；溶劑用量考察了稀乙醇25、50、75mL三種用量，結果表明稀乙醇25mL提取已較完全，與稀乙醇50、75mL的結果無顯著差異，故選擇稀乙醇用量為25mL；提取時間考察了超聲提取15、30、45、60min，結果表明超聲提取30min已較完全，與超聲提取45、60min的結果無顯著差異，故選擇提取時間為30min。

[參考文獻]

[1] 國家藥品監督管理局.國家中成藥標準匯編·中成藥地方標準上升國家標準部分[S].外科（婦科分冊）：426-429.

[2] 鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等.芍藥苷藥理作用研究新進展[J].中國藥物警戒，2012，9（2）：100-103.

[3] 吳瓊蓮，何繼祥，程靜，等.HPLC法測定八珍益母片中芍藥苷含量[J].中國藥師，2007，10（10）：982-983.

[4] 林麗洋，賀英菊，陳艷，等.阿歸養血片質量標準的研究[J].中成藥，2007，29（3）：375-378.

[5] 鐘美霞，肖佳尚，勞海燕.HPLC法測定通絡膠囊中芍藥苷含量[J].廣東藥學院學報，2007，23（3）：252-253.

[6] 孫學勤，洪蓮，許凡，等.牡丹皮中芍藥苷含量測定方法的研究[J].宿州學院學報，2007，22（3）：109-112.

[7] 王曉玲，鄧平.反相高效液相色譜法測定更年靜心膠囊芍藥苷含量[J].醫藥導報，2007，26（11）：1362-1363.

[8] 龐鵬.歸芍合劑中丹參的鑒別和芍藥苷的含量測定[J].藥學與臨床研究，2007，15（3）：249-250.

[9] 彭文進，楊芳.反相高效液相色譜法測定舒心寧片中芍藥苷含量[J].中國藥業，2007，16（22）：34-35.

[10] 張俊紅，劉桂林，陳平.高效液相色譜法測定健肝樂軟膠囊中芍藥苷含量[J].醫藥導報，2007，26（12）：1504-1505.

[11] 劉平，王艷君.RP-HPLC法測定調經祛斑片中芍藥苷的含量[J].中國藥房，2007，18（36）：2850-2852.

[12] 王曉玲，陳振德，鄧平.更年靜心膠囊質量標準研究[J].中國藥房，2007，18（36）：2834-2836.

[13] 謝海萍，劉柳毅.骨刺膠囊的質量標準研究[J].中國當代醫藥，2015，22（19）：9-11.

[14] 國家藥典委員會.中國藥典[S].第一部.北京：化學工業出版社，2005：68-69.

（收稿日期：2015-03-22）