KDM1A對胃癌侵襲轉移能力的影響

徐麗偉+丁杰

[摘要] 目的 在組織和細胞水平探討KDM1A的表達水平，并分析其對胃癌侵襲轉移的影響。 方法 通過Western Blot技術檢測胃癌組織及胃癌細胞中KDM1A蛋白的表達；通過Transwell侵襲實驗檢測胃癌細胞的侵襲性；利用RNA干擾技術抑制胃癌細胞BGC823中KDM1A的表達。 結果 在胃癌組織及胃癌細胞株中KDM1A蛋白質表達升高；胃癌細胞的侵襲轉移能力與KDM1A 蛋白表達量之間均存在正相關關系；siRNA-KDM1A可在體外干擾胃癌細胞BGC823中KDM1A蛋白表達，并影響BGC823的侵襲轉移能力。 結論 KDM1A在胃癌組織及細胞中表達上升，在體外實驗中抑制KDM1A表達，可抑制胃癌細胞的侵襲轉移。

[關鍵詞] 胃腫瘤；KDM1A基因；侵襲轉移

[中圖分類號] R273.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）23-0001-04

The impact of KDM1A on the invasion and metastasis of gastric cancer

XU Liwei1 DING Jie2

1.Department of Thoracicta Tumor Surgery， Tumor Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery， Guizhou People's Hospital， Guiyang 550002， China

[Abstract] Objective To explore the expression level of KDM1A in tissues and cell lines， and to analyze its impact on the invasion and metastasis of gastric cancer. Methods Used western blot to detect KDM1A protein expression in gastric cancer tissue and gastric cancer cell lines. Used transwell invasion assey to detect gastric cancer cell lines in vitro. Used RNA interference technique to silence KDM1A in gastric cancer cell line BGC823. Results There was higher KDM1A protein expression in gastric cancer tissues and cell lines. There was positive correlation between protein KDM1A expression and invasive and metastatic ability of gastric cancer cell lines. siRNA-KDM1A interfered BGC823 KDM1A protein expression in gastric cancer cells in vitro， and affected BGC823 ability of invasion and metastasis. Conclusion There is higher KDM1A expression in gastric cancer tissues and cell lines， and the decrease of KDM1A expression inhibits the invasion and metastasis in vitro.

[Key words] Gastric cancer； KDM1A genes； Invasion and metastasis

長期以來，世界范圍內，胃癌在腫瘤疾病中發病率居高不下，發病年齡主要集中于40～60歲，男女比例約為2∶1。胃癌轉移復發是影響胃癌患者預后的主要因素之一，因胃癌早期自覺癥狀不易引起重視，而我國胃癌全民普查機制尚未完善，故此初診時部分患者病情已至進展期。進展期胃癌患者術后出現轉移復發可能性高，預后及生活質量均不理想。因此眾多研究者將目光投向胃癌侵襲轉移機制研究，以期為胃癌的治療提供新思路、新方法，提高腫瘤患者的生存期。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（KDM1A）位于人類1號染色體短臂3區6帶12亞帶。KDM1A是第一個被定義的組蛋白特異性去甲基化酶，能夠特異性的去除組蛋白H3第4位及第9位賴氨酸的一甲基及二甲基化，實驗發現[1]KDM1A在多種腫瘤組織及細胞中表達升高，如前列腺癌[2-4]、乳腺癌[5-7]、膀胱癌[8，9]、結直腸癌[10]、肺癌[11]及中樞神經系統腫瘤[12]。KDM1A可能參與多條信號通路，影響了腫瘤發生、生長、增殖、侵襲轉移等多個環節[4，13-15]。本實驗將在組織及細胞水平探討KDM1A在的表達，并通過RNA干擾技術抑制KDM1A的表達，分析其對胃癌細胞增殖侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 組織標本

收集2012年6月～2013年1月于中南大學湘雅醫學院行手術切除的胃癌及癌旁標本40對，液氮保存。通過電子病歷系統查詢患者性別、年齡、分期等情況。按國際抗癌聯盟（UICC）的TNM標準，進行病理分期，患者術前未實施輔助化療，均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料

胃癌細胞株AGS、SGC7901、BGC823及人胚胃上皮細胞GES1，均購自中南大學湘雅醫學院細胞研究中心。KDM1A單克隆抗體購于美國Abcom公司，GAPDH單克隆抗體購于美國SANTACRUZ公司，總蛋白抽提試劑盒購于美國ProMab公司，Western Blot試劑盒購于東陽紡生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 GES-1：培養條件：DMEM培養基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。AGS：培養條件： F-12培養基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。SGC-7901：培養條件：RPMI-1640培養基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。BGC-823：培養條件：RPMI-1640培養基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。

1.3.2 Western Blot實驗 利用總蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA（bicinchonininc acid）法測定蛋白質濃度，取40 μg蛋白上樣，200 V恒壓電泳，SDS-PAGE分離，300 mA恒流、4℃轉膜， 約70 min，5%PBS 37℃封閉2 h，分別加入兔抗人KDM1A單克隆抗體（1∶1 000）及鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶800），4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，分別加入羊抗兔及羊抗鼠HRP單克隆抗體（1∶80 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加底物，做化學發光，得到膠片。對于培養細胞，每實驗組設置3個平行樣本，計算均值及方差。

1.3.3 體外Transwell實驗檢測胃癌細胞侵襲性 實驗所用細胞包括三種胃癌細胞株（AGS、SGC7901、BGC823）及人胚胃上皮細胞株GES1。細胞懸液制備：以胰蛋白酶消化各實驗組細胞，以PBS漂洗3次，以各株細胞對應的無血清培基調節細胞密度，約1×104個細胞/mL。細胞接種：Transwell上室接種制備好的細胞懸液約2 mL，Transwell下室加入以各株細胞對應的含血清培基，以各株細胞對應的培養條件培養約24 h。細胞計數：除去基質膠和上室內的細胞，酒精固定，蘇木素染色，倒置顯微鏡觀察計數。實驗組于倒置顯微鏡下隨機觀察3個視野，計算均值及方差。

1.3.4 siRNA-KDM1A構建 在GenBank中檢索人源KDM1A序列，KDM1A的基因信息為：NM_001009999.2，Homo sapiens lysine （K）-specific demethylase 1A （KDM1A），transcript variant 1， mRNA，并設計KDM1A mRNA 的siRNA：

正義鏈5-CCGGAUGACUUCUCAAGAATT-3，反義鏈5-UUCUUGAGAAGUCAUCCGGTT-3。

以上目標序列由上海吉瑪制藥技術公司合成。同時合成陰性對照序列KDM1A negative control：正義鏈 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反義鏈5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.3.5 細胞轉染（LipofectamineTM 2000） 細胞預處理： 將約1×105個細胞接種于0.5 mL去雙抗培養基，按培養條件，培養24 h后觀察細胞密度，約為50%。細胞轉染：分別用250 μL Opti-MEM稀釋siRNA-KDM1A、siRNA-NC及轉染試劑，而陰性對照組只以250 μL Opti-MEM稀釋轉染試劑，加入混合后室溫孵育約25 min，取混合物加入實驗孔中，每孔100 μL。觀察計數：混勻后按培養條件，培養6 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，培養48 h后，進行后續實驗。

1.4 統計學方法

使用STATA/MP13.0統計軟件進行統計學分析。使用t檢驗對連續數據進行組間均數比較，F檢驗進行方差分析，Bonferroni方法進行多組間兩兩比較，Spearman秩相關分析進行相關性檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床病理特征

實驗標本為40對胃癌及癌旁組織，來自隨機自愿參加實驗的40例患者。40例患者包括男24例，女16例。年齡最大者為71歲，年齡最小者為37歲，平均（51.3±7.8）歲。根據UICC的TNM分期標準（2010年第7版），Ⅰ期患者4例，Ⅱ期患者13例，Ⅲ期患者21例，Ⅳ期患者2例。

2.2 KDM1A 蛋白在胃癌及癌旁組織中的相對表達量

以Western Blot方法檢測胃癌及癌旁組織中KDM1A的相對表達，經t檢驗，兩者之間具有統計學差異（t=16.15，P<0.05），胃癌組織中KDM1A蛋白相對表達量（0.67±0.18）高于癌旁組織（0.19±0.05）。見封三圖1A。

2.3 KDM1A蛋白在胃癌細胞中的相對表達量

以Western Blot方法檢測人胚胃上皮細胞株GES1及三種胃癌細胞株（AGS、SGC7901、BGC823）中KDM1A的相對表達。KDM1A 蛋白相對表達量在四種細胞中分別為：GES1：0.26±0.08；AGS：0.43±0.09；SGC7901：0.57±0.25；BGC823：0.86±0.12。經F檢驗，四組之間具有統計學意義（F=8.06，P<0.05）。見封三圖1B～C。

2.4 胃癌細胞侵襲能力檢測

以Transwell實驗檢測人胚胃上皮細胞株GES1及三種胃癌細胞株（AGS、SGC7901、BGC823）的侵襲轉移能力。在每個隨機視野中，四株細胞穿膜細胞數分別為GES1：26.0±2.0；AGS：43.2±2.5；SGC7901：81.4±5.6；BGC823：112.1±3.5。經F檢驗，四組穿膜細胞數不完全相等（F=331.91，P<0.05）。見封三圖1D。

2.5 KDM1A的表達與細胞侵襲性的相關性分析

經Spearman秩相關分析，在四株細胞中，穿膜細胞數與KDM1A蛋白表達量之間呈正相關（r=0.89，P<0.05）。

2.6 siRNA-KDM1A對胃癌細胞BGC823中KDM1A表達的影響

以Western Blot法檢測siRNA-KDM1A組、siRNA-NC組及陰性對照組中KDM1A蛋白質表達。在三個實驗組中，KDM1A相對表達量分別為陰性對照組：0.71±0.17；siRNA-NC組：0.78±0.09；siRNA-KDM1A組：0.10±0.05。經F檢驗，三組之間KDM1A表達量不完全相等（F=31.88，P<0.05）。siRNA-KDM1A組表達量低于siRNA-NC組（t=-0.68，P<0.05）、陰性對照組（t=-0.60，P<0.05），而siRNA-NC組與陰性對照組之間無統計學意義（t=0.07，P>0.05）。見封三圖1E。

2.7 siRNA-KDM1A對胃癌細胞BGC823侵襲性的影響

siRNA-KDM1A轉染胃癌細胞BGC823后，使用Transwell方法檢測siRNA-KDM1A組、siRNA-NC組及陰性對照組中細胞的侵襲能力。在每個隨機視野中，三個實驗組穿膜細胞數分別為陰性對照組118.6±4.0；siRNA-NC組：122.3±8.3；siRNA-KDM1：59.6±3.7。經F檢驗，三組之間穿膜細胞數目不完全相等（F=111.32，P<0.05）。siRNA-KDM1A組穿膜細胞數低于siRNA-NC組（t=-62.67，P<0.05）、陰性對照組（t=-59，P<0.05）；siRNA-NC組與陰性對照組之間無統計學意義（t=3.67，P>0.05）。見封三圖1F。

3 討論

通過實驗結果可以發現，KDM1A蛋白相對表達量在胃癌組織中高于癌旁組織，體外實驗也證明，胃癌細胞中KDM1A蛋白相對表達量也高于正常胃上皮細胞。同時，體外侵襲實驗證明在胃癌細胞中KDM1A高表達預示著更強的侵襲轉移能力，而利用RNA干擾技術抑制KDM1A表達后，胃癌細胞侵襲能力減弱。

既往的研究已證實，KDM1A在多種上皮來源腫瘤中高表達，這種表達增高預示著更差的預后生存期[21]。導致這種現象的原因可能是KDM1A參與多條信號通路，影響了腫瘤發生、生長、增殖、侵襲轉移等多個環節[4，13-15]。腫瘤侵襲轉移是惡性腫瘤最顯著的生物學特性之一，也是臨床腫瘤患者的主要死因。KDM1A表達增高使腫瘤細胞侵襲轉移能力增強，具體作用機制是多樣的，主要通過與其他因子構成復合體結合于基因啟動子區，改變基因啟動子區甲基化狀態而改變基因表達[7，13，16-19]。

KDM1A可與多種因子結合而調節下游基因表達，如Snai1[17]、Slug[18]、JARID1B/NuRD[16]等。Snai1指蛋白轉移因子家族在上皮間質轉化中充當了調節介質的作用，Snai1能夠抑制上皮型蛋白表達（如E-鈣粘蛋白），從而促進上皮間質轉化的進行。Snai1可招募KDM1A于上皮表型基因啟動子區。在侵襲性腫瘤細胞中KDM1A對Snai1介導的轉錄抑制及維持Snai1靶基因沉默狀態十分重要。若KDM1A表達沉默則Snai1無法抑制E-鈣粘蛋白表達。在E-鈣粘蛋白表達沉默的腫瘤細胞中，若KDM1A耗盡E-鈣粘蛋白啟動子區H3K4me2水平上升，而且部分上皮型基因表達上升。這些可能表明KDM1A在上皮間質轉化相關的腫瘤侵襲中發揮重要作用[17]。Slug亦可招募KDM1A于BRCA1基因啟動子區E-boxes，而抑制BRCA1表達[18]。KDM1A可與JARID1B/NuRD形成復合體起到轉錄抑制的作用，全基因組轉錄分析證實上皮趨化因子CCL14[13]及TGFbeta1[16]信號通路均受到此復合體的調控。CCL14表達受到抑制后造成乳腺癌細胞血管生成及侵襲能力減弱，而TGFbeta1則與乳腺癌細胞生長增殖及上皮間質轉化有關。

此外，KDM1A可通過特異性去除p53第370位賴氨酸甲基抑制p53介導的細胞凋亡，促進細胞增殖[19]。同時可促進BCL2及c-myc表達，抑制細胞凋亡，促進細胞分裂[20，21]。

因KDM1A中包含一個胺氧化酶（amine oxidase like，AOL）結構域，故一些已合成的或已應用于臨床的單胺氧化酶抑制劑可抑制KDM1A的催化活性，如丙炔甲基芐胺[9]、苯乙肼[22]、反苯環丙胺等[23]。而KDM1A被抑制后，腫瘤細胞的侵襲轉移能力降低，因此，有研究者認為KDM1A擁有成為治療靶點的潛能。

本研究的局限在于僅選取了同一所臨床醫院、同一時期內的40對臨床標本，取樣范圍、時間較局限，總樣本量較少，可進一步延長實驗跨度、擴大樣本，明確KDM1A與胃癌臨床病理特征之間的關系。在體外實驗中，僅對KDM1A表達量較高、侵襲性較強的胃癌細胞株BGC823進行了RNA干擾實驗，而針對其他多種胃癌細胞株的干擾實驗可更全面地了解KDM1A對胃癌侵襲轉移能力的影響。

綜上所述，KDM1A在胃癌組織及細胞中表達上升，在體外實驗中抑制KDM1A表達，可抑制胃癌細胞的侵襲轉移。KDM1A有可能成為腫瘤治療的新靶點。

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（收稿日期：2015-04-08）