10株產菊粉酶細菌的篩選及鑒定

張艾艾　潘建剛　張超君等

摘要： 以包頭當地菊芋根際土為材料，篩選到10株產菊粉酶細菌，其中芽孢桿菌的產酶活性相對較高。對部分菌株的鑒定結果表明，產菊粉酶細菌分屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），它們分別是短桿菌（Brevibacterium sp ）（A1）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） （A3）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa） （A6、A8）、桿菌屬（Bacillus sp ）（A7）。目前關于短桿菌屬、多黏類芽孢桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌具有產菊粉酶能力的報道較少見。

關鍵詞： 菊粉酶；細菌；篩選；鑒定

中圖分類號： Q939 9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0360-03

菊粉酶（inulinase）是糖基水解酶 32 家族（glycosyl hydrolases family 32）的一員，又稱β-2，1-D-果聚糖酶，它能特異地作用于β-2，1-D-果聚糖果糖苷鍵 [1-4]。根據其作用于底物的方式不同，又可分為內切菊粉酶（endoinulinase，EC 3 2 1 7） 和外切菊粉酶（exoinulinase，EC 3 2 1 80），目前該酶被廣泛用于菊芋制備低聚果糖的工業生產，這主要是因為菊芋富含菊糖，而菊糖是由D-呋喃果糖分子經β-2，1糖苷鍵聚合而成的聚合度較高的直鏈多糖，在菊粉酶的作用下，它可以從內部和末端水解自身的β-2，1糖苷鍵，從而降解為低聚果糖 [5-8]。而微生物由于來源廣泛，種類多，它已經成為菊粉酶篩選的良好來源，但是迄今為止，在工業上還是很缺乏具有高產酶活性的功能菌株。因此，如何篩選獲得具有高產菊粉酶活性的目的菌株已經成為眾多研究者的關注焦點 [9-15]。這其中又以產菊粉酶真菌的研究居多，而對于細菌的研究較少。因此，本研究以內蒙古包頭當地菊芋種植的根際土壤為材料，定向篩選產菊粉酶細菌，以期為菊芋制備低聚果糖提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1 1 材料與試劑

菊芋根部土壤來源于包頭市東河區沙爾沁鎮。菊粉、瓊脂、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，購自上海藍季科技發展有限公司。3，5-二硝基水楊酸，購自上海遠帆助劑廠。冰醋酸、酒石酸鉀鈉、KCl、NaNO3、K2HPO4、（NH4）H2PO、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，購自天津市風船化學試劑有限公司。上述藥品均為分析純。

DNS 試劑：取3，5-二硝基水楊酸3 15 g，加水500 mL，水浴至45 ℃，逐步加入100 mL 0 2 g/mL氫氧化鈉，然后加入酒石酸鉀鈉91 g、苯酚2 5 g、無水亞硝酸鈉 2 5 g，攪拌使之溶解，冷卻后定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中，放置 1 周后使用。

醋酸緩沖液（0 1 mol/L，pH值4 6）：準確稱取醋酸鈉 0 803 6 g，加少量蒸餾水溶解，再加入冰醋酸 0 59 mL，調節pH 值至4 6，加蒸餾水定容至200 mL。

1 2 培養基配制

富集培養基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。初篩培養基：菊粉30 g，KCl 0 5 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，FeSO4 0 01 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水 1 000 mL，瓊脂15 g。復篩培養基（同發酵培養基）：菊粉20 g，蛋白胨10 g，（NH4）2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaNO3 5 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15 g（發酵培養基無）。 斜面保藏培養基：馬鈴薯 20 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15～20 g，pH值自然。

1 3 菌株篩選

富集培養：取菊芋根際土5 g，放入100 mL無菌水中，170 r/min振蕩1 h得懸浮液，將1 mL搖勻的懸浮液加入含有50 mL富集培養液的三角瓶中，37 ℃下170 r/min 振蕩培養48 h。

初篩：將經過富集培養的菌液用無菌水稀釋為10 -1、10 -2、10 -3、10 -4等4個不同的濃度，分別吸取0 5 mL不同濃度土壤懸液于初篩培養基上，涂布均勻后，把培養皿倒置放入恒溫培養箱中，28 ℃培養2～3 d，并觀察菌種的生長情況，利用“透明圈法”對目的菌落進行分離純化，最后對所得的菌株進行斜面培養保藏。

復篩：利用純化與酶活性測定相結合的方法復篩產菊粉酶細菌，先將純化的目的菌株接種于復篩培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d；然后選取生長較快的菌株接入含有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min恒溫水浴搖床培養72 h；發酵液3 500 r/min離心15 min，得到的上清液即為粗酶液；最后用DNS法測定粗酶液酶活性，從中獲得產酶活性較高的菌株。

1 4 酶活性的測定

1 4 1 果糖標準曲線的繪制 試驗方案見表1，將各試管沸水浴7 min，顯色后快速冷卻，之后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后在550 nm下測吸光度，以果糖濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制果糖標準曲線，結果如圖1所示。

1 4 2 酶活性的測定 菊粉酶活性單位定義 [16]：反應體系中1 min轉化底物產生 1 μmol 還原糖所需的酶量即為1個活性單位（U/mL）。酶活性測定參照文獻[17]，略有改動。向0 5 mL粗酶液中加入2 5 mL 1%菊糖（醋酸緩沖液配制），37 ℃ 反應20 min，沸水滅活10 min，加入DNS 2 mL，沸水浴中7 min顯色，快速冷卻后加5 mL蒸餾水定容到10 mL，以去離子水為空白對照，用可見分光光度計測吸光度。設3次重復，取平均值。endprint

1 4 3 酶活性的計算 按下面的公示來計算單位酶活性 [15]：酶活性=D·n·1 000/（k·t）。式中：n為稀釋倍數；k為曲線斜率；t為反應時間（s）。

1 5 產菊粉酶細菌的16S rRNA分子鑒定和系統發育分析

利用菌落PCR技術擴增所得目的菌株的16S rRNA序列，引物選用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）， 具體方法參考文獻[18]。然后利用Blast程序尋找GenBank中與各目的序列同源性最高的序列作為參考，最后用ClustalX 1 81軟件進行序列多重比對，利用MEGA 4軟件以Neighbor-Joining法進行系統發育分析 （采樣量1 000次），構建系統發育樹 [18]。

2 結果與分析

2 1 產菊粉酶菌株產酶活性測定

由圖2可見，10株產菊粉酶細菌的產酶活性隨時間的延長呈規律性變化，除菌株A1、A4外，其他菌株的產酶活性都是第1天最高，此后呈下降趨勢；而菌株A1、A4的產酶活性以第2天最高，此后開始下降。

酶活性的產菊粉酶細菌，并對其中部分菌株加以鑒定。測序結果表明，產菊粉酶細菌多為厚壁菌門，此外也包含放線菌門和變形菌門，且來自厚壁菌門和放線菌門的細菌可能具有較好的產菊粉酶活性，如彼爾姆短桿菌（A1）和芽孢桿菌（A7）要高于多黏類芽孢桿菌（A6、A8），而變形菌門的細菌產菊粉酶活性則較差。

張揚等曾篩選到一株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），而且該菌的產酶活性在培養2天后達到最高 [4]，這與本研究中的菌株A4產酶性能一致，因此A4也可能是巨大芽孢桿菌。Pandey等發現產菊粉酶的細菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬 （Staphylococcus）和埃希菌屬（Escherichia）等許多類型 [19]，而本研究則發現，除上述細菌外，短桿菌屬（Brevibacterium sp ）、多黏類芽孢桿菌（P polymyxa）和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）也具有產菊粉酶能力，只不過這3類細菌產菊粉酶能力較弱。因此，本研究后續將關注利用紫外誘變、化學突變技術以及重離子誘變技術來獲取高產菊粉酶活性菌。

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