安塞油田驅油微生物多樣性研究及篩選

楊劍，李斌，董小麗，楊娜，張蓓（.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西延安　76000；.中國石油長慶油田分公司技術監測中心，陜西西安　7008；.中國石油長慶油田分公司生產運行處，陜西西安　7008）

安塞油田驅油微生物多樣性研究及篩選

楊劍1，李斌1，董小麗2，楊娜3，張蓓1
（1.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西延安716000；2.中國石油長慶油田分公司技術監測中心，陜西西安710018；3.中國石油長慶油田分公司生產運行處，陜西西安710018）

利用微生物及其代謝產物作用于原油提高采收率，首先必須了解油藏本源微生物種類，進行油藏微生物菌種多樣性分析。提取安塞油田油水樣品，進行菌種分離培養、提取和純化DNA，設計適合的引物進行目的基因PCR擴增、高通量測序，對序列結果進行生物信息學分析，得到安塞油田驅油微生物多樣性研究結果。分析認為安塞油田本源微生物種類豐富，主要是芽孢桿菌綱、梭菌綱、α-變形菌綱及γ-變形菌崗等細菌，又以芽孢桿菌崗屬占優勢分布。在此基礎上篩選出一株產生物表面活性劑微生物，發酵液稀釋30倍后與原油的界面張力僅為1.727 6 mN/m，具有較強的降低油水界面張力的能力，篩選出一株產生物聚合物微生物，發酵液中生物聚合物含量高達800 mg/L，具有較強的產生物聚合物能力。最終由這兩種微生物菌種構建微生物驅油體系。

低滲透油藏；驅油微生物；分子生物學；生物表面活性劑；生物聚合物

油藏微生物菌種多樣性分析目前主要采用分子生物學DNA標記方法［1］。多樣性檢測的分子標記主要包括：限制性片段長度多態性（RFLP）、隨即擴增多態性DNA（RAPD）、DNA擴增指紋分析（DAF）、擴增片段長度多態性（AFLP）、16SrRNA基因序列分析等，目前應用較為廣泛的是基于微生物16SrRNA特異性基因序列的標記技術。16SrRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA，大小約1.5 kb左右。其種類少、含量大（約占細菌RNA含量的80％），分子大小適中，存在于所有的生物中，特別是其進化具有良好的時鐘性質，在結構和功能上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱。16SrRNA既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術來較容易地得到其序列，故被微生物學家及分類學家所接受［2］。

通過從環境樣品中提取和純化DNA，設計適合的引物進行目的基因PCR擴增、測序，對序列結果進行生物信息學分析，即可得到相應的多樣性分析結果。該結果對目標油藏微生物種質資源調查提供基礎資料，對油藏的后期開發中有效驅油菌株的構建有指導作用。

1　試驗材料及儀器

1.1試驗材料

E.Z.N.A Soil DNA試劑盒（OMEGA公司）、瓊脂糖凝膠、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）、TransStart FastPfu DNA Polymerase（聚合酶）、TransGen AP221-02、Tris-HCl緩 沖 液 、EmPCR（Roche emPCRAmp-Lib_L Kit公司）。

1.2實驗儀器

ABI GeneAmpR9700型PCR儀、QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）、Roche Genome Sequencer FLX+（測序系統）、mothur軟件、JYW-200A 表/界面張力儀、SVT-20旋轉滴界面張力儀（德國）、恒溫箱。

2　試驗方法及結果

2.1驅油微生物多樣性研究

2.1.1基因組DNA提取采集安塞油田長6油藏油樣6個，用采樣容器分別取水樣1 L，油樣1 L（油水分離，經濾紙除雜），封口并記錄井號，做好試樣標記，放置于4℃的條件下保存備用。

對采樣的6個樣品使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

2.1.2引物設計按指定測序區域，合成帶有“5'454 A、B接頭-特異引物3'”的融合引物，A為測序端，需加標簽，B端引物可共用。為保證后續數據分析的準確性及可靠性，需滿足兩個條件：（1）盡可能使用低循環數擴增；（2）保證每個樣品擴增的循環數一致。隨機選取具有代表性的樣品進行預實驗，確保在最低循環數中絕大多數樣品能夠擴增出濃度合適的產物［3］。

表1引物序列

圖1　熒光定量標準曲線

2.1.3PCR擴增每個樣品3個重復，將同一樣品混合后用2％瓊脂糖凝膠電泳，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2％瓊脂糖電泳檢測，2 μL上樣檢測［4］。

2.1.4熒光定量將已構建好的PCR產物文庫參照電泳初步定量結果，使用 Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測［5］，得到標準曲線（見圖1）。

6個樣品待測PCR產物文庫濃度較高（均高于4 ng/μL），足以滿足下一步測序要求，數據（見表2）。

表2　PCR產物文庫定量結果統計表

2.1.5測序及數據分析將每個樣品的測序量比例混合，使用EmPCR產物，使用Roche Genome Sequencer FLX+上機測序。分析步驟：（1）去除序列末端的接頭序列、后引物序列、多堿基N、polyA/T尾巴及低質量序列；（2）去除（1）中所得序列的條形碼標簽序列、前引物序列；（3）丟棄長度短于200 bp、模糊堿基數大于0、序列平均質量低于25的序列［6］。

優化后樣品平均長度446 bp，數據統計結果（見表3）。

表3　有效序列數據統計

表4 樣品OTU列表（部分）

表4 樣品OTU列表（部分）（續表）

2.1.6多樣性分析及結果采用OTU聚類分析方法［7］，將所有測序結果作為OUT數，先將相似度均達到97％以上的1對序列聚為一類，即為1個OUT，名稱為OTU1，再重新比較剩余序列中哪1對相似度均可以達到97％以上，將其聚為一類，命名為OTU2，如此反復計算，直至完成所有分析。此次分析應用mothur軟件進行。

6個樣品共計聚類得到1 050個OTU，各OTU中每個樣品豐度不一，數據（見表4）。其中樣品中含量最豐富的是芽孢桿菌綱細菌，其次是梭菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱細菌；主要菌屬為芽孢桿菌屬、乳酸球菌屬、環絲菌屬、假黃色單胞菌屬、色鹽桿菌屬等（見表4）。

2.2驅油微生物篩選

微生物增產和作用于原油非常復雜，一般有多種生物化學過程相互作用。微生物在油藏中的作用有：微生物本身聚集或生成生物聚合物堵塞高滲透透層并改變水驅方向；生成表面活性劑，增加殘余油流動力；產生CO2或甲烷，增加氣體壓力；消化大分子，降低原油黏度等［8］。

2.2.1產生物表面活性劑微生物篩選采用稀釋分離法［9］將油井采出水進行梯度稀釋后，取菌液涂平板，將混雜的菌種在瓊脂平板表面上分散，培養獲得單菌落。利用產生物表面活性劑的微生物具有溶血的特性，在血平板上形成透明圈，以此現象初步篩選出產表面活性劑的驅油菌株DN001、DN005、DN035，溶血圈直徑分別為4.1 mm、3.3 mm和3.5 mm。將三種微生物菌株分別接種到200 mL液體搖瓶培養基中，150 r/min、37℃條件下搖床培養48 h，用SVT-20旋轉滴界面張力儀對安塞油田地層水、培養基、三株微生物稀釋的發酵液進行界面張力測定，數據（見表5）。

安塞油田原油與地層水界面張力為11.423 2 mN/m， 30倍稀釋的DN001菌株發酵液與原油的界面張力為1.727 6 mN/m，說明DN001菌株發酵液具有較強的降低油水界面張力的能力，產表面活性劑性能最好（見圖2）。

表5　油水界面張力的測定

圖2　DN001菌株發酵液界面張力測定

采用液相色譜、液質分析方法對發酵液中的代謝產物的種類進行鑒定，主要次級代謝產物是鼠李糖脂和脂肽，屬于糖脂類和脂肽類生物表面活性劑（見圖3，圖4）。

2.2.2產生物聚合物微生物篩選采取稀釋分離法獲得微生物單菌落，進行菌種純化，初步分離篩選20株微生物，按3％比例接入發酵培養基（葡萄糖培養基不加瓊脂），150 r/min，37℃搖床培養72 h，測定發酵液粘度。菌株DN002、DN016、DN022和DN034的發酵液粘度較高均在15 mPa·s以上，初步選擇這四株菌進行后續試驗。

用安塞油田地層水配制搖瓶發酵培養基，將上述4種微生物菌株3％的比例分別接種到培養基中，模擬油田地層溫度，在45℃，150 r/min的條件下，搖床振蕩培養。每隔8 h測定菌液濃度，繪制生長曲線，測定發酵液粘度，優選出產生生物聚合物的最佳菌株（見圖5，圖6）。

圖5　菌株生長曲線對比

圖6　發酵液粘度隨時間變

由圖5，圖6可知，菌株DN002培養8 h即進入對數生長期，24 h后進入穩定期，而且穩定期長達24 h，產生的菌濃度最高，培養32 h時最大菌濃為6.5×108個/毫升。菌株DN016和DN034的菌濃度也相對較高，但穩定期相對較短。4種發酵液粘度達到最大值之后，均能穩定保持。其中菌株DN002在32 h即可達到最大粘度值26 mPa·s，32 h～72 h粘度值變化不大。而其它三種微生物的最大粘度值均小于DN002，且在達到最大粘度值后都有所降低。因此，綜合菌種濃度和發酵液粘度兩項因素，確定選擇DN002作為用來產生生物聚合物的目的菌。

圖3　DN001發酵液液相色譜254 nm測定結果

圖4　DN001發酵液液質鑒定結果

對DN002菌株接種于發酵液體培養基中，置于45℃、150 r/min培養箱中振蕩培養，5 d后對其產生聚合物進行分析測定。將培養后的培養液離心（8 000 r/min～9 000 r/min，30 min），用移液管吸取上清液，用5倍體積95％的酒精沉淀生物聚合物，收集生物聚合物并用95％的酒精洗滌，50℃恒溫烘箱中烘干后稱重，經檢測生物聚合物含量為800 mg/L。

2.2.3微生物分子生物學檢測對篩選出來的兩種菌株進行分子生物學16SrRNA檢測。通過PCR擴增得到目的基因片段，經測序為1 500 bp左右的16SrRNA部分序列，利用GenBank Blast在線比對進行序列同源性比較，結果顯示菌株DN001的16SrRNA序列與多株假單胞菌具有高度同源性，菌株DN002和CYR602與枯草芽孢桿菌有高度同源性。通過Clustal X進行聚類分析后，利用MEGA4.1軟件生成系統發育進化樹（見圖7，圖8）。

圖7　DN001菌株的系統進化樹

圖8　DN002菌株的系統進化樹

3　結論

（1）安塞油田本源微生物種類豐富，6個樣品中均檢測到了大量種屬的本源微生物。其中1號樣微生物種類最多，含有4個菌綱6 992種微生物；6號樣微生物種類最少，有11個菌綱4 589種微生物。本源微生物以芽孢桿菌綱占絕對優勢，1號樣中芽孢桿菌綱微生物高達6 985種，3號樣中芽孢桿菌綱微生物最少有3 019種，分別占到了總菌屬的99.9％和61.8％。在兩個樣品的屬種分布中，又以芽孢桿菌屬占優勢分布，分別占到了94.22％和31.34％。

（2）對微生物稀釋、分離、純化，篩選出產生物表面活性劑微生物DN001，屬于假單胞菌，發酵液稀釋30倍與原油的界面張力僅為1.727 6 mN/m，具有較強的降低油水界面張力的能力。微生物DN002屬于枯草芽孢桿菌，具有較強的產生物聚合物能力，發酵液中生物聚合物含量高達800 mg/L，且該微生物生長能力較強，培養8 h即進入對數生長期，快速繁殖，24 h后進入穩定期，而且穩定期長達24 h，產生的菌濃度最高為6.5× 108個/毫升。

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Flooding microbial diversity research and screening of Ansai oilfield

YANG Jian1，LI Bin1，DONG Xiaoli2，YANG Na3，ZHANG Bei1
（1.Oil Production Plant 1 of PetroChina Changqing Oilfield Company，Yan'an Shanxi 716000，China；2.Technical Testing Center of PetroChina Changqing Oilfield Company，Xi'an Shanxi 710018，China；3.Product Managment Department of PetroChina Changqing Oilfield Company，Xi'an Shanxi 710018，China）

Using microorganisms and their metabolic products to improve recovery of crude oil，firstly understand reservoir source of microbial species，analysis of oil reservoir microbial species diversity.Extracting oil and water samples of Ansai oilfield，separating strains of cultivation，extracting and purificating of DNA，designing a suitable primers for PCR amplification，sequencing high-throughput gene，analysising the sequence result of bioinformatics，ansai oilfield flooding microbial diversity research results of Ansai oilfield are obtained.Ansai oilfield source microorganism is variety，mainly bacillus classes is clostridium，alpha deformation and gamma phylum bacteria such as and belong to the dominant distribution with bacillus hillock.On the basis of the screened strains produce surfactants microorganisms，fermented liquid and interfacial tension of crude oil after 30 times dilution was only 1.727 6 mN/m，hasstrong ability to reduce the oil-water interfacial tension，and screened strains produce polymer microorganisms，biological polymer content in the fermented liquid is as high as 800 mg/L，has the strong ability of producing polymer content.Finally by the two strains build microbial oil displacement system.

low permeability；displacement of microbial；molecular biology；biosurfactant；biopolymers

10.3969/j.issn.1673-5285.2015.01.005

TE357.46

A

1673-5285（2015）01-0016-07

2014－10-10

楊劍，女（1983-），采油工程師，2013年碩士畢業于中國石油大學（北京）石油與天然氣專業，現從事油田提高采收率工作，郵箱：yjian2_cq@petrochina.com.cn。