ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，葛金芳，陳飛虎

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，葛金芳，陳飛虎

飼養(yǎng)并繁殖酸敏感離子通道1（ASIC1）基因敲除雜合子小鼠，提取小鼠尾部組織DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法鑒定子代小鼠基因型。ASIC1基因敲除小鼠的繁育和鑒定均獲得成功，子代小鼠基因型分別為雜合子（ASIC1+/－）、純合子（ASIC1－ /－）和野生型（ASIC1+/+）。

ASIC1;基因敲除小鼠;PCR

酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一類胞外H+激活的陽離子通道，屬于阿米洛利敏感的上皮鈉通道/退變素（epithelial Na+channels/degenerin，ENaC/DEG）超家族［1］。ASIC1被發(fā)現(xiàn)其對Na+和Ca2+有通透性，廣泛分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)組織中，并且有重要的生理和病理意義［2］。鑒于在ASIC1基因缺失細(xì)胞中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的不足，而轉(zhuǎn)基因小鼠能夠做到從整體動物水平上模擬相關(guān)靶基因的功能，因此在積累了一定前期研究基礎(chǔ)后，該實(shí)驗(yàn)通過繁育和鑒定ASIC1基因敲除小鼠，獲得一定數(shù)量的敲除小鼠，這也為深入探究ASIC1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供了一個動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ASIC1基因敲除小鼠購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，利用CRISPR（clusters of regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9技術(shù)獲得，許可證號:SCXK（滬）2011－0031，無特定病原體（SPF級）。小鼠的品系是C57BL/6J，雄性1只、雌性2只，基因型為雜合子（ASIC1+/－）。

1.1.2 主要器材與試劑 器材:梯型 PCR儀、Centrifuge 5424R冷凍離心機(jī)（德國eppendorf公司）;瓊脂糖水平電泳槽（美國 Bio-Rad公司）;ZHJHC1209B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）。試劑:細(xì)胞/組織基因組 DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）;6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）;PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)有限公司）;PCR Master Mix（2×）（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 ASIC1基因敲除小鼠的飼養(yǎng)及繁殖 小鼠在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)與繁殖。實(shí)驗(yàn)動物遵照國家實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用指南，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，動物房內(nèi)濕度控制在50% ～70%，溫度20～26℃，12 h明/12 h暗交替光照，小鼠籠具、飼料、墊料、飲用水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，每天穿無菌隔離服、口罩、手套，進(jìn)入動物房1次，觀察并拍照記錄小鼠生長繁殖情況。墊料每3～4 d更換1次，同時補(bǔ)充飼料和飲用水。采用將性成熟的小鼠（6～9周齡）以雄雌比例1∶2同籠合養(yǎng)進(jìn)行小鼠的繁殖;用于交配繁殖的小鼠每周給予滅菌雞蛋和瓜子以補(bǔ)充營養(yǎng)。雌雄小鼠的妊娠期為19～21 d，仔鼠出生23～30 d（10～12 g）后進(jìn)行斷奶、分籠;對于健康狀況欠佳的小鼠給予適量無菌奶粉增強(qiáng)體質(zhì)。

1.3 小鼠的基因型鑒定

1.3.1 小鼠組織DNA的提取 小鼠出生3～4周后，使用耳標(biāo)鉗對小鼠進(jìn)行打耳釘標(biāo)記，剪取小鼠尾尖長約0.3～0.5 cm，置于與耳釘編號一致的1.5 ml無菌離心管中，在液氮中將尾尖組織研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml的離心管中;使用試劑盒（離心柱型）提取小鼠基因組DNA，步驟:① 加入400 μl ACL Solution 和10 μl的 Proteinase K 震蕩混勻1 min;②置于55℃水浴1～3 h，在此期間可以適當(dāng)搖晃，以促進(jìn)裂解;③ 取出樣品依次加入300 μl Ext Solution 和300 μl AB Solution 混勻，12 000 r/min離心5 min，溶液分為上層藍(lán)色抽提層和下層透明水相層，DNA在下層水相中;④ 將下層溶液吸到GenClean Colunm中，8 000 r/min離心1 min，棄去離心管中廢液;⑤將GenClean Colunm放回收集管，加入 500 μl Wash Solution，8 000 r/min，室溫離心 1 min，重復(fù)1次;⑥ 再次12 000 r/min室溫離心1 min，將柱放入新的潔凈1.5 ml離心管中，在柱中央加入50～100 μl Elution Buffer室溫放置 2 min;⑦然后12 000 r/min離心1 min，離心管中收集的液體則為DNA。對提取DNA測量光密度（optical density，OD）值后，加ddH2O保存于－20℃。

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 設(shè)計(jì)ASIC1基因擴(kuò)增引物序列，上游引物:5'-TTCCATCTCTGCCTATCTAT-3';下游引物:5'-ATAGTCTATACCACGACCTT-3'。PCR擴(kuò)增體系:根據(jù)PCR Master Mix（2×）使用說明，按25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。分別加入如下反應(yīng)物:前段引物（100 μmol/L）0.5 μl、后段引物（100 μmol/L）0.5 μl、2 × Taq PCR Master Mix（0.05 U/μl）12.5 μl、DNA 模板 1.0 μl，加 ddH2O 補(bǔ)足至 25 μl。采用PCR儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增條件設(shè)置如下:95℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃ 延伸1 min，循環(huán)40次;72℃ 5 min終止反應(yīng)。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳及基因型判定方法 配制1.2%瓊脂糖凝膠:0.3 g瓊脂糖粉，20 ml 1×TAE電泳緩沖液;上樣:5 μl PCR 產(chǎn)物和 1 μl Loading Buffer;之后進(jìn)行電泳分析，電泳電壓80 V，時間30 min。

小鼠基因型鑒定結(jié)果的判定方法:由電泳結(jié)果顯示出條帶位于360 bp處為基因純合子小鼠;而電泳條帶位于548 bp處則為野生型小鼠;兩條帶（360、548 bp）均存在的為基因雜合子小鼠。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖及生長情況 兩只配種的ASIC1基因敲除雜合子雌鼠4個月內(nèi)共產(chǎn)下子代仔鼠31只，仔鼠由母鼠母乳喂養(yǎng)，新生小鼠為粉紅色，無毛發(fā)（圖1A）;哺乳期約25 d，仔鼠成活30只，其中雄性小鼠14只，雌性小鼠16只（圖1B）。

2.2 PCR鑒定子代小鼠基因型結(jié)果 根據(jù)孟德爾遺傳定律，其子代小鼠可能出現(xiàn)的3個基因表型為雜合子（ASIC1+/－）、純合子（ASIC1－/－）及野生型（ASIC1+/+）。圖2中編號1、2小鼠的電泳條帶位于548 bp和360 bp處為基因雜合子;編號4、5小鼠的電泳條帶位于360 bp處為基因敲除純合子;條帶處于548 bp位置的3、6號小鼠為野生型。經(jīng)鑒定，ASIC1+/－小鼠17只;ASIC1－/－小鼠5只;ASIC1+/+小鼠8只。

3 討論

酸堿平衡是維持正常生理活動的重要條件之一，幾乎各種疾病如缺血、炎癥、低氧、癌癥等的過程都會引起不同程度的pH值變化，而ASICs作為酸重要的感受器，其影響著組織病理生理的改變。ASIC1a因其可以參與Ca2+內(nèi)流的調(diào)控并具有廣泛的生物學(xué)功能和重要的病理生理學(xué)價值成為研究的熱點(diǎn)［3］。研究［4］表明在腦缺血病灶的腦室內(nèi)敲除ASIC1a基因或注射ASIC1a阻滯劑都可以對缺血性腦損傷起到保護(hù)作用。而在含有Ca2+的 pH=6.0培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時就會增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，ASIC1a阻滯劑能夠很明顯降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加并抑制酸誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨損傷［5－6］。組織酸化可以迅速活化ASICs開放，從而導(dǎo)致Ca2+超載并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞損傷。因此深入探究ASIC1蛋白在機(jī)體內(nèi)部的作用機(jī)制，將有助于明確各種疾病的發(fā)生機(jī)制，也有助于疾病的治療。近些年來，已有采用ASIC1敲除小鼠研究ASIC1蛋白在機(jī)體中的生理和病理作用［7－8］。但目前國內(nèi)一般使用ASIC1基因表達(dá)沉默的細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，由于機(jī)體內(nèi)整體環(huán)境相當(dāng)復(fù)雜，因此僅從細(xì)胞水平研究ASIC1蛋白的功能還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是目前生物技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展較快的基因工程手段。轉(zhuǎn)基因動物在研究基因的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)蛋白功能以及與之相關(guān)的疾病方面，較以往腺病毒過表達(dá)系統(tǒng)以及小干擾RNA等研究手段有顯著的優(yōu)越性。本研究購買的ASIC1基因敲除小鼠均為雜合子，采用雜合子雌鼠與雜合子雄2∶1配對，根據(jù)孟德爾遺傳定律，其后代可能出現(xiàn)純合子（ASIC1－/－）、雜合子（ASIC1+/－）和野生型（ASIC1+/+）3種基因型。PCR因其具有快速、靈敏、費(fèi)用低等特點(diǎn)，逐漸取代了傳統(tǒng)的Southern雜交，被廣泛應(yīng)用于對基因敲除小鼠基因型的鑒定，但在PCR擴(kuò)增中，如果實(shí)驗(yàn)條件不合適（引物設(shè)計(jì)不合理、模板DNA質(zhì)量不高或被污染等），都容易導(dǎo)致不可靠或無可重復(fù)性的PCR擴(kuò)增結(jié)果;本研究亦是采用PCR成功鑒定出ASIC1敲除鼠的基因型。在繁殖的過程中，定期全面檢查繁殖雌鼠，建立完整的繁殖記錄，留種的小鼠應(yīng)注意補(bǔ)充蛋白質(zhì)，特別是哺乳的母鼠要給予雞蛋和葵花籽補(bǔ)充營養(yǎng)，避免營養(yǎng)不足導(dǎo)致的食子現(xiàn)象。獲得的ASIC1－/－小鼠可用于相關(guān)疾病的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，而ASIC1+/+小鼠可用做實(shí)驗(yàn)的陰性對照，ASIC1+/－小鼠可用來留種;但體型較小的性成熟小鼠，應(yīng)飼養(yǎng)一定時間后再配種或不用于配種，避免遺傳對仔鼠的生長發(fā)育的影響。經(jīng)過一段時間繁殖后，目前本教研室已獲得了一定數(shù)量的ASIC1基因敲除小鼠，這為深入研究ASIC1在相關(guān)疾病中的作用提供了前期基礎(chǔ)。

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Reproduction and genotype identification of ASIC1 knockout mice

Zhou Renpeng，Wu Xiaoshan，Wang Zhisen，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei230032）

To breed and identify acid sensing ion channel 1（ASIC1）gene knockout mice，so as to lay the foundation for studying ASIC1 protein.The heterozygote mice were bred and reproduced.Genome DNA extracted from the murine tail was subjected to PCR test for genotype identification.Breeding and reproducing of ASIC1 knockout mice were both successful，and the genotypes of the offspring mice were heterozygous（ASIC1+/－ ），homozygous（ASIC1－ /－），and wild-type（ASIC1+/+）.Appropriate methods of breeding，reproducing and identifying can effectively obtain ASIC1－/－ mice.

ASIC1;knockout mice;PCR

R-332

A

1000－1492（2015）09－1341－03

2015－03－31接收

國家自然科學(xué)基金（編號:81271949）

安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

周仁鵬，男，碩士研究生;

陳飛虎，男，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:cfhchina@sohu.com