先天性無虹膜家系致病基因的突變檢測

耿仁芳，鄭 潔，周 青，汪 淵，李壽玲

先天性無虹膜家系致病基因的突變檢測

耿仁芳1，鄭 潔1，周 青2，汪 淵2，李壽玲1

目的 對一常染色體顯性遺傳的先天性無虹膜（AN）家系進行PAX 6基因突變篩查，以確定其致病基因及致病突變。方法 收集一常染色體顯性遺傳的AN家系，采集該家系患者、家族健康成員外周靜脈血，提取基因組DNA，應用聚合酶鏈式反應（PCR）方法擴增PAX 6基因exon 4～exon 13共11個外顯子以及外顯子－內含子拼接部，將純化后的PCR擴增產物直接測序，運用DNAStar軟件（綜合性序列分析軟件）對測序結果進行序列分析，檢測PAX 6基因的突變類型，并與80名隨機抽取的與該家系無血緣關系的健康人PAX 6基因序列進行比對。結果 該家系患者PAX 6基因exon 11存在一個雜合突變c.949 C＞T（P.R 317 X），導致第317位精氨酸的密碼子CGA被終止密碼子UGA替代，造成編碼PAX 6蛋白的過早終止，而該家系其他健康成員及80名與該家系無血緣關系的健康對照組成員均未檢測到該突變。結論 PAX 6基因c.949 C＞T（P.R 317 X）突變導致PAX 6蛋白提前編碼終止是該常染色體顯性遺傳先天性無虹膜家系的致病原因。

先天性無虹膜;PAX 6基因;基因突變

李壽玲，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E－mail:shoulingli@126.com

先天性無虹膜（OMIM 106210，congenital aniridia，AN）是臨床上較為罕見的一種眼畸形疾病，具有遺傳性，其發病率為1 ∶64 000 ～1 ∶100 000［1］。約2/3的AN病例呈家族性，多為常染色體顯性遺傳，具有較高外顯率，但表現度不一，其余1/3病例呈散發性，無種族和性別差異［2］。主要臨床特征是虹膜組織的退化，表現為雙眼虹膜的部分或完全缺失，可合并有眼部或全身其他異常表現，如角膜血管翳、白內障、青光眼、WAGR 綜合征等［3］。PAX 6基因為目前該病發現的唯一致病基因，1991年，PAX 6基因便作為AN的候選基因被定位克隆，將其定位于人類11號染色體短臂1區3帶（11 p 13）［4］。到目前為止，已鑒定出與AN相關的PAX 6基因突變方式多達300余種，并收錄在人類PAX 6基因突變數據庫（http://pax6.hgu.mrc.ac.vk）中。該研究是對一AN家系中的AN患者進行PAX6基因的突變檢測，以期確定該家系的分子遺傳學的致病原因。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選擇2014年3月在安徽醫科大學第一附屬醫院眼科就診并確診的一AN患者（先證者），進行詳細病史詢問并確定該患者有家族史，該家系成員均為中國漢族，3代共13名成員，包括3名患者（1名患者已逝）和10名正常人，以上家系成員否認近親婚配史。隨機抽取80名與該家系無血緣關系的漢族健康人群作為對照。

1.2 研究方法

1.2.1 遺傳學調查及樣本采集 由經驗豐富的眼科專家對該家系12名健在成員進行詳細病史詢問及多項專科檢查，如視力（裸眼視力和最佳矯正視力）、角膜、虹膜、晶狀體、眼底、眼壓等，分析家系遺傳特征，并詳細繪制家系遺傳圖譜。遵守世界醫學會《赫爾辛基宣言》中涉及人類受試者醫學研究的倫理原則和知情同意原則，分別采集該家系患者、家系其他健康成員以及80名與該家系無血緣關系的健康對照者的外周靜脈血，均為4 ml，EDTA抗凝，置于－86℃冰箱中保存備用。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用經典酚－氯仿提取法提取所有研究對象外周靜脈血白細胞基因組DNA，溶于 TE 緩沖液（10 mmol/L Tris－HCl 1 mmol/L EDTA，pH=8.0）中。檢測濃度及純度合格后，置于－86℃冰箱中保存備用。

1.2.3 引物設計和合成 查詢NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得PAX 6基因序列，根據參考文獻［4－5］合成PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，擴增PAX 6基因exon 4～exon 13共11個外顯子以及外顯子－內含子拼接部，引物序列見表1。

1.2.4 PCR擴增目的基因 所有反應均在PCT－2000型溫度梯度PCR儀上進行，以稀釋至20 ng/μl的基因組DNA為模板，PCR反應體系為:Premix Taq（含 Buffer、dNTPMixture 及 DNA Polymerase）25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板 DNA 16 μl，滅菌蒸餾水 7 μl，共 50 μl。PCR 反應條件:94 ℃預變性4 min;按94℃變性30 s，根據不同引物的退火溫度退火復性35 s，72℃延伸30 s的順序，循環35次;最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠，恒壓100 V電泳30 min后，置于UV型紫外線透視儀下觀察，產物條帶單一、清晰明亮、無雜帶、長度符合理論要求才是所需的特異性目的片段。

表1 擴增PAX 6基因exon 4～exon 13及其附近內含子的引物

1.2.5 PCR產物純化和序列分析 PCR擴增產物經由上海生工生物工程股份有限公司純化后，在ABI 3730 XL測序儀上對其進行雙向直接測序，測序結果采用DNAStar軟件進行分析。

2 結果

2.1 臨床表現 先證者（Ⅲ4）:男性，6歲，雙眼矯正視力0.12，眼球水平震顫，角膜透明，虹膜全部缺失，右眼晶狀體尚透明，左眼晶狀體皮質渾濁，雙側視網膜顏色正常，血管走形大致正常，黃斑部顯示欠清，中心凹反光未見，眼壓正常，眼前節照片見圖1。先證者母親（Ⅱ3）:女性，38歲，雙眼裸眼視力0.08，角膜透明，虹膜缺如，僅見周邊部有少許殘余虹膜，晶狀體混濁，眼底窺不清，眼壓正常，上述兩名患者均未發現全身其他系統并發癥。該家系連續3代成員中，每代均有發病者，其中男性患者1名，女性患者2名，無性別差異，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，家系圖譜見圖2。

2.2 PAX6基因突變檢測 對所有研究對象PAX 6基因進行雙向測序，結合GenBank基因組數據庫，采用DNAStar軟件對測序結果進行對比分析發現，該家系兩名患者（Ⅱ3，Ⅲ4）的PAX 6基因exon 11測序圖存在堿基C突變為T的雜合雙峰見圖3，該突變導致第317位精氨酸密碼子CGA被終止密碼子UGA替代，造成編碼PAX 6蛋白的過早終止。在家系健康成員及80名對照組健康人群中未發現該突變。

3 討論

PAX 6基因是眼球發育的主要控制基因，在角膜、虹膜、晶狀體、視網膜、視盤等中均有表達，研究［4］證實，PAX 6基因是AN的主要致病基因，PAX 6突變最普遍的表現就是先天性虹膜缺失，同時還可伴有角膜變性、青光眼、白內障、視盤和黃斑發育不全等其他眼部異常，甚至導致個體發育異常，如多趾、足內翻、顱骨發育不全、智力發育不全、Wills瘤等。PAX 6基因的突變方式多樣，包括無義突變、移碼突變、剪切突變、錯義突變、框內缺失或插入突變和連綴突變，其中以無義突變、移碼突變和剪切突變較為多見。在AN的分子遺傳學研究［6－7］中，無虹膜表型的出現多由無義突變、移碼突變和剪切突變引起，該類突變使肽鏈合成提前終止，產生截短蛋白，導致無效等位基因產生，引起基因單倍劑量不足。研究［8］表明只要PAX 6等位基因突變造成截短蛋白的產生，不論突變類型和發生在基因中的什么位置，其表型甚至都是無虹膜。國內外多個研究［9－10］表明AN患者臨床表現類型與 PAX 6基因突變類型間無明顯聯系，相同的基因突變類型可導致不同的臨床表現，甚至在同一家系中，相同突變類型的不同患者間都會存在很大差異。由PAX 6基因突變所致的AN患者中，散發性比例占25%，遺傳學比例可高達50.5%［11］。

人類PAX 6基因位于第11號染色體短臂13位點（11 p 13），全長33 170 bp，含14個外顯子，其cDNA的編碼區自exon 4末至exon 13，編碼一個含422個氨基酸的轉錄調控因子。該基因結構至少包括4個功能區:成對結構域（PD，編碼128個氨基酸），同源結構域（HD，編碼61個氨基酸），存在于PD與HD間的由78個氨基酸組成的連接體（LNK），以及與HD羧基端相連的一個富含絲氨酸、脯氨酸和蘇氨酸共153個氨基酸的轉錄激活域（TAD），其中PD的氨基末端還包括一個由14個氨基酸組成的選擇性外顯子5a，exon 5a使PD結合DNA的特異性發生改變，PD氨基端亞結構域不能結合DNA，從而轉為羧基端亞結構域結合DNA而產生不同生物學功能，可見exon 5a具有作為某些指定靶基因的分子開關功能［6－12］。

在本研究中，該AN家系患者中均發現相同的雜合性PAX 6基因c.949 C＞T（P.R 317 X）突變，而家系中健康成員和80名健康成員中均未發現此突變，該突變造成截短蛋白的產生，即無效等位基因生成，基因單倍劑量不足，進而導致無虹膜的發生。根據人類基因突變及疾病相關數據庫記載，該突變類型已被報道，在多個不同國家和地區的無虹膜家系和散發患者中均有報道，并與c.607 C＞T和c.718 C ＞ T 列為最普遍的突變熱點［10－11，13］，在我國人群中亦有報道［14－15］，該同類突變類型可以導致多種臨床表型，所以對PAX 6基因功能進一步研究將有助于闡述PAX 6突變導致不同臨床表型的潛在機制，本研究結果亦支持c.949 C＞T為最常見的一種突變。先天性無虹膜的遺傳方式主要是常染色體顯性遺傳，患者后代的發病率高達50%，此病在常規產前檢查中難以發現，所以對有AN家族史的孕婦行產前基因檢測以預防該病的發生很有必要，可對家系成員再次生育進行產前診斷和遺傳咨詢，從而預防后代中再次出現患病者有重要意義。

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Mutation analysis of the PAX 6 gene in a Chinese family

Geng Renfang1，Zheng Jie1，Zhou Qing2，et al
（1Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Laboratory of Molecular Biology，Anhui Province and Key Laboratory of Gene Resource Utilization for Severe Disease Ministry of Education PCR，Hefei230032）

ObjectiveTo identify the mutation of the PAX 6 gene in a Chinese family with autosomal dominant hereditary congenital aniridia（AN）.MethodsGenomic DNA from peripheral blood of the AN patients was extracted，the relatives of the AN family，and the 80 normal controls were extracted.The exons contain exon4 to exon 13 and the flanking introns of the PAX 6 gene were amplified by PCR and sequenced bi－directionally.The sequencing results were analyzed by DNAStar software.ResultsA heterozygous c.949 C＞T transition in the exon 11of PAX 6 was detected，which resulted in the substitution of a termination codon for a highly conserved arginine codon（P.R 317 X）.It was not detected in the unaffected relatives and unrelated control members.ConclusionThe heterozygous mutation（c.949 C＞T）of the PAX 6 gene is the pathogenic cause of the AN family.

congenital aniridia;PAX 6 gene;mutation

R 773.1;R 394.3

A

1000－1492（2015）09－1312－04

2015－03－13接收

1安徽醫科大學第一附屬醫院眼科，合肥 230022

2安徽醫科大學教育部“重要遺傳病基因資源利用”重點實驗室（省部共建），合肥 230032

耿仁芳，女，碩士研究生;