人肥大細胞羧肽酶真核表達重組質粒DNA的免疫原性觀察

(廣東醫學院醫學檢驗學院，廣東東莞 523808)

肥大細胞(MC)是一類重要的免疫細胞，在超敏反應、腫瘤等疾病的發生發展中通過活化MC產生并釋放炎癥介質而發揮重要作用［1］。MC羧肽酶(MC-CP)是MC特異性蛋白酶，是過敏反應性疾病的生物標志物［2，3］。天然MC-CP的純化極為困難，我們曾用原核表達技術制備了重組人MC-CP(hMCCP)及其抗體，通過原核表達獲取的hMC-CP重組蛋白不具天然構象，獲取的hMC-CP抗體所針對的表位為線性表位［4］;而構象表位通常是優勢表位，針對構象表位的抗體才具有更高的檢測靈敏度。DNA免疫作為一種以核酸為基礎的全新免疫接種技術，外源基因在小鼠體內表達出具有天然構象的蛋白，激發機體發生免疫應答，并可用于抗體的制備。基于難于獲取具有天然結構的hMC-CP，為進一步獲取針對構象表位的hMC-CP抗體，2010年8月～2011年3月，我們進行了hMC-CP真核表達重組質粒DNA的免疫原性研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1載體、大腸桿菌DH5α，純化的重組hMC-CP蛋白［5］以及分泌型hMC-CP真核表達質粒(pcDNA3.1/S-CP)［6］由本室制備并保存;pGEM-T載體，DNA 凝膠回收試劑盒與質粒抽提試劑盒，KpnⅠ、XhoⅠ限制性內切酶和T4DNA連接酶，無內毒素質粒大提試劑盒，DAB，HRP標記的羊抗鼠IgG，常規試劑為國產分析純。PCR引物合成及DNA序列測定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠，雌性，6周齡。

1.2 方法

1.2.1 hMC-CP編碼區基因片段的擴增 以含hMC-CP基因的質粒［5］為模板，用以下引物做PCR擴增，P1:5'-GGTACCGCCGCCGCCATGAACTCATCCTGCCTGTGGG-3'(有下劃線者為 KpnⅠ酶切位點)，P2:5'-CTCGAGTTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3'(有下劃線為XhoⅠ酶切位點)。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現1條長約1 300 bp的條帶，與預期結果相符。DNA測序結果表明，片段為1 269 bp的hMC-CP編碼區基因與GenBank中公布的DNA序列完全一致。回收純化PCR產物，與pGEM-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，轉化菌液涂布于含 100 g/ml Amp和IPTG-Xgal的LB平板上37℃培養過夜，挑取單個白色菌落進行培養，提取重組質粒，以 KpnⅠ 和XhoⅠ進行雙酶切鑒定;并選取陽性克隆行DNA測序，用Blast軟件進行DNA序列同源性分析，陽性克隆命名為pGEM-T/CP。

1.2.2 非分泌性真核表達載體的構建 將質粒pGEM-T/CP和pcDNA3.1分別用KpnⅠ和XhoⅠ行雙酶切，分別純化、回收。回收產物經T4 DNA連接酶連接后，轉化感受態大腸桿菌DH5α。挑取白色菌落進行培養，提取質粒，雙酶切鑒定后，陽性克隆行DNA測序鑒定，陽性克隆命名為pcDNA3.1/CP，約為1 300 kb的DNA片段，與預期結果相符;DNA測序結果表明，目的片段正確插入表達載體pcDNA3.1;Blast同源性分析顯示，目的基因編碼序列正確，閱讀框正確，可用于進一步的重組表達。

1.2.3 免疫試驗分組與處理 將40只BALB/c小鼠隨機分為8組，各5只。其中4組采用肌注，另外4組則采用皮下注射。肌注:后肢脛前肌注射質粒100 μg/只(每條腿 50 μg)，4 組注射物分別為分泌性表達重組質粒pcDNA3.1/S-CP、非分泌性表達重組質粒組 pcDNA3.1/CP、pcDNA3.1 空白質粒、相同劑量NS。皮下注射:背部皮下多點注射，注射物分組同上。間隔免疫時間2周，共免疫3次。末次免疫后第7天摘眼球取血，分離血清，凍存備用。

1.2.4 免疫原性觀察 用純化的重組hMC-CP蛋白包被酶標板，采用間接ELISA法檢測免疫血清的效價。反應完畢后，用酶標儀測波長450 nm處的OD值。以待檢血清OD值＞陰性血清OD值2倍以上者的最大稀釋倍數確定為其效價。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。數據比較進行兩組獨立樣本的t檢驗。P≤0.05為差異有統計表意義。

2 結果

以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA 免疫小鼠后，均誘導產生抗hMC-CP抗體，而pcDNA 3.1空載體和NS則不能。通過肌注途徑，以pcDNA 3.1/S-CP免疫小鼠所得血清抗體效價均值為1∶6 400，以 pcDNA3.1/CP 免疫小鼠所得血清抗體效價均值為1∶3 200，兩者比較，P ＞0.05。通過皮下注射途徑，以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA免疫小鼠所得的5份免疫血清抗體效價均值均為1∶3200，兩者比較，P ＞0.05。同一載體肌肉與皮下免疫，所得血清抗體效價比較，P＞0.05。

3 討論

MC-CP是MC的特異標志物，其檢測有助于過敏性疾病的診斷，而高質量的抗體對提高檢測的靈敏度和特異性具有重要作用。我們曾用原核表達制備了hMC-CP重組蛋白，并以之為免疫原制備其抗體，但為不具有針對抗原構象表位的抗體［4］。其原因可能為原核表達不能對翻譯的蛋白質進一步修飾加工，不能進行正確的折疊，不具有天然蛋白的結構。此后，我們嘗試以中國倉鼠卵巢細胞(CHO)為宿主細胞進行體外真核表達，未能獲取具有活性的重組hMC-CP，可能與該蛋白的加工成熟機制尚不清楚有關。有研究表明［7］，MC-CP的加工成熟可能還需要MC細胞內其他酶的參與。DNA免疫將編碼抗原基因的質粒DNA注入小鼠體內不僅可表達相應的轉基因產物，同時還可激發特異性免疫應答的發生［8］。由于DNA免疫模擬了機體在自然狀態下體內表達抗原及誘生免疫的過程，免去了繁瑣的蛋白純化步驟，只需將編碼抗原的DNA片段克隆到真核表達載體上，提取重組質粒DNA免疫動物，即可產生針對該抗原的抗體。

MC-CP基因編碼的產物是1個含417個氨基酸的酶原，由信號肽、活化肽和成熟酶組成，成熟MCCP才具有活性。為研究hMC-CP信號肽對其分泌表達是否有影響，我們曾成功構建了hMC-CP的分泌型真核表達載體［6］。本實驗中，我們成功構建了hMC-CP的非分泌型真核表達載體。

基因免疫常用的注射途徑有肌肉、皮內、皮下、脾臟、靜脈、腹腔免疫等，其中以肌肉注射免疫途徑較為常用。接種方法可用基因槍免疫、裸DNA免疫、脂質體包裹DNA免疫等，其中裸DNA免疫較為常用。本實驗選擇了以裸質粒DNA分別進行肌肉免疫和皮下免疫，分別以分泌型與非分泌型hMCCP真核表達載體的裸質粒DNA免疫小鼠，收集小鼠血清檢測到抗hMC-CP抗體，二者的效價近似(P＞0.05)，相同質粒以肌肉和皮下途徑進行免疫，獲取抗體效價近似(P＞0.05)。提示，hMC-CP真核表達重組質粒DNA具有較好的免疫原性，表達質粒是否為分泌性表達不影響其免疫原性，其免疫原性也不受質粒DNA注射途徑的影響。

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［4］Zhou YC，Chen ZQ，He S.Preparation，characterization and epitope mapping of McAb specific to human mast cell carboxypeptidase［J］.Scand J Immunol，2006，64(10):564-570.

［5］陳章權，何素輝，陸田田，等.兔抗人肥大細胞羧肽酶抗體的制備與鑒定［J］.細胞與分子免學雜志，2007，23(9):859-861.

［6］陸田田，陳章權.人肥大細胞羧肽酶分泌型真核表達載體的構建［J］.現代醫藥衛生，2008，24(22):3346-3348.

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