兔頸動脈球囊損傷后動脈內膜、中膜厚度及面積的時相性變化

崔麗，張恩園，李廣平，楊萬松，焦占全

(天津醫科大學第二醫院，天津 300211)

冠狀動脈再狹窄(RS)影響冠心病介入治療患者的長期預后，藥物洗脫支架使再狹窄率明顯降低，但仍維持在5%～12%［1，2］。動脈血管的彈性回縮、血栓形成、血管壁負性重塑及血管壁中層平滑肌細胞的增殖均參與經皮冠狀動脈腔內血管成形術(PTCA)術后再狹窄這一復雜的病理生理過程［3，4］。2012年12月～2014年12月，我們通過制作兔頸動脈球囊損傷模型，觀察球囊損傷后動脈內膜、中膜厚度及面積的時相性變化，探討平滑肌細胞(VSMC)增殖在再狹窄中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康長耳白兔60只，雌雄不限，體質量(2.0±0.2)kg，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，標準兔料，自由攝食水，適應性飼養1周。

1.2 頸動脈球囊損傷模型的建立及分組 將60只白兔隨機分為對照組(10只)及球囊損傷組(50只)，對照組正常飼養28 d處死。球囊損傷組先對白兔進行稱質量，術前15 min予肝素鈉鹽水(500 U/kg)、3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經耳緣靜脈注射，待兔出現肌力下降、軟癱等麻醉反應后，固定于實驗動物臺，常規備皮、消毒，頸部正中切口，逐層切開，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，血管夾夾閉頸總動脈、頸內動脈，選用冠脈2.5 mm×15 mm球囊，自頸外動脈近心端插入球囊導管至主動脈弓處，連接手推式壓力泵，回拉至頸總動脈分叉處，迅速撤壓，回送至主動脈弓處，壓力為8～16 ATM共5次，導管撤出，結扎頸外動脈，恢復頸總動脈、頸內動脈血流;對側只分離頸動脈，不予球囊損傷，逐層縫合傷口，慶大霉素4萬U噴灑傷口，4萬U肌注。球囊損傷術后1 h耳緣靜脈注射2 mL的0.5 mg/mL的伊文氏藍，注射后2 h處死2只，自主動脈跟部取下雙側頸總動脈血管標本，球囊損傷側血管較正常側血管擴張且著色明顯，明顯藍染，對側只有輕度著色。余48只白兔正常飼養至術后3、7、14、28 d，于以上時點各處死 12 只并取材。損傷側動脈段為模型組(Model組)，損傷對側頸動脈段作為假手術組(Sham組)。

1.3 動脈內膜、中膜形態學觀察及厚度、面積測算按照實驗分組設計時間，3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉，頸部正中切口，沿頸總動脈向下分離至主動脈弓，向上分離至頸外動脈結扎處，生理鹽水反復沖洗，取約1.0 cm動脈段，置于新鮮配制的4%多聚甲醛、2%戊二醛磷酸緩沖液(pH 7.4)固定。石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察移行平滑肌細胞增殖和內膜增厚情況。按組織學劃分，內彈力膜以內為血管內膜，內、外彈力膜之間為中膜。5倍物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算機圖像分析系統，應用圖像處理軟件隨機選取10個點分析，測量內膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)，并計算血管內膜、中膜厚度比(IT/MT);選取3個切面測量相應內膜面積(IA)、中膜面積(MA)，計算內膜與中膜面積比(IA/MA)。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量數據以表示，多組間比較進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈內膜、中膜形態學變化 對照組及Sham組動脈內膜光滑完整，管腔通暢，內膜、中膜和外膜分界清楚。內膜和中膜以波浪狀完整連續的內彈力板為界，中膜層為4～6層平滑肌細胞同心圓排列，周圍可見彈力纖維組織。Model組術后3 d，內皮細胞脫落，暴露內皮下的網狀結構，內膜表面炎性細胞浸潤，中層彈力纖維增多。Model組術后7 d，部分內彈力板斷裂，內膜輕度增厚，中層平滑肌細胞數目增多，彈力纖維增多，中膜厚度增加。Model組術后14 d，新生內膜厚度明顯增加，細胞外基質(膠原和彈力纖維)增加，中膜厚度有所下降，管腔相對縮窄。Model組術后28 d，內膜明顯不規則增生，增生的細胞呈梭形，少量泡沫細胞浸潤，平滑肌細胞排列紊亂，細胞外基質大量分泌。見圖1。

圖1 各組頸動脈HE染色(×200)

2.2 動脈IT、MT、IA、MA變化 結果見表1。

表1 各組頸總動脈IT、MT、IA、MA比較()

表1 各組頸總動脈IT、MT、IA、MA比較()

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與 Sham 組相比，ΔP ＜0.05;與 Model組損傷后3 d相比，○P ＜0.05;與 Model組損傷后7 d相比，□P ＜0.05;與 Model組損傷后14 d相比，☆P ＜0.05。

組別 n IT(μm) MT(μm) IT/MT IA(μm2) MA(μm2)IA/MA Sham 組損傷后3 d 12 2.37±0.12 52.6±1.9 0.045±0.003 6403.6± 559.5 148514± 8339 0.04±0.005損傷后7 d 12 2.35±0.09 52.3±1.8 0.045±0.002 6422.7± 552.4 151902± 8429 0.04±0.005損傷后14 d 12 2.41±0.12 52.5±1.1 0.046±0.003 6362.9± 347.7 150215±13850 0.04±0.005損傷后28 d 12 2.46±0.25 52.1±1.5 0.047±0.004 6209.3± 178.0 152270±16637 0.04±0.004 Model組損傷后3 d 12 2.33±0.30 61.1±12.2 0.039±0.006 6862.2± 1029.5 270968±75741* Δ 0.03±0.012損傷后7 d 12 8.72± 2.79 93.4±22.1* Δ○ 0.090±0.030 8577.1± 1311.1 349631±59138* Δ○ 0.03±0.004損傷后14 d 12 42.26±12.36* Δ○□ 80.8±13.5*Δ○□ 0.511±0.130* Δ○□ 105879.4±35546.1* Δ○□ 390756±112567* Δ○ 0.27±0.058* Δ○□損傷后28 d 12 132.15±35.88* Δ○□☆ 84.3±7.6* Δ○□ 1.580±0.447* Δ○□☆ 354490.6±164047.6* Δ○□☆ 521067±157346*Δ○□☆ 0.66±0.136* Δ○□☆對照組 10 2.39±0.14 52.4±1.6 0.046±0.003 6756.9± 977.9 151434±16652 0.05±0.009

3 討論

頸動脈球囊損傷模型是動脈粥樣硬化及再狹窄研究常用的動物模型［5］，本實驗中采用經頸外動脈入路直接球囊擴張拖拉兔頸動脈造成內皮剝脫模擬PTCA后內皮損傷，復制再狹窄形成過程，頸部動脈易于分離、肉眼直視下操作，手術操作簡單，模型動物存活率高、重復性好，頸總動脈較長，獲得實驗組織較多，利于進一步的分子生物學及病理學實驗。此外通過注射伊文氏藍觀察損傷后血管出現明顯藍染，表明內皮損傷成功，其主要機制為伊文氏藍能與血漿中蛋白完全結合，在內皮屏障遭到破壞時進入內皮下出現藍染從而反映內皮損傷的程度［6］。

RS形成是一個復雜的病理生理過程，內膜增生、彈性回縮、血栓、炎癥均參與其中［7，8］。本研究動態觀察損傷后頸動脈的IT及IA時相性變化，發現損傷3 d時內膜表面炎性細胞浸潤，中膜彈力纖維增多，少量平滑肌細胞增殖，MA較對照組擴大，7 d時中膜平滑肌細胞數目及彈力纖維增多，MT、MA增加明顯，IT較對照組有增加趨勢，14 d時IT、IA明顯增加，而MT有所下降，28 d時IT、IA繼續增厚達高峰，MT較14 d時無明顯差異，IT/MT及IA/MA在損傷后14 d明顯增大，28 d時達高峰，表明急性損傷后3～7 d中膜血管平滑肌細胞開始明顯增殖，術后7～14 d為中膜血管平滑肌細胞向內膜下遷移和再增殖過程，術后14～28 d內膜增生的血管平滑肌細胞合成大量的細胞外基質，導致管腔的狹窄和血管負性重塑，最終導致RS形成。上述結果與國內外文獻［8～10］報道的再狹窄模型病理改變基本一致，模擬了臨床冠狀動脈成形術后的病理變化，表明經頸外動脈入路可成功建立頸總動脈損傷模型，可用于再狹窄的病理、機制及藥物干預研究。同時內膜時相性變化提示血管平滑肌細胞的增殖、向內膜遷移及細胞外基質分泌，血管負性重構均在再狹窄形成中發揮重要作用，但更深入的分子機制尚需進一步研究。

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