姜黃素對(duì)大鼠肝纖維化防治作用*

吳雄健 朱海燕

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 贛州 341000）

肝纖維化是由多種原因所引起的慢性肝損害所致病理改變，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分過(guò)度異常地沉積，影響肝臟的功能[1]。姜黃素是一種酚類(lèi)化合物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗肝纖維化作用。但是，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于姜黃素抗肝纖維化作用的研究多限在肝星狀細(xì)胞水平觀察姜黃素對(duì)一些細(xì)胞因子、核因子等的影響，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察姜黃素防治肝纖維化作用及其機(jī)制的研究較少見(jiàn)。本文采用四氯化碳中毒誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，分析姜黃素的抗肝纖維化作用及其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體重120～160 g，由原第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組造模

60只大鼠正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為A（正常組）、B（模型組）、C（高劑量姜黃素組）、D（中劑量姜黃素組）、E（低劑量姜黃素組）、F（陽(yáng)性組）共6組，每組各10只。其中A組不予任何處理，其他5組大鼠給予恒量四氯化碳油溶液（天津市北宏試劑廠分析純）0.175 ml（四氯化碳與食用花生油以1∶6的比例配制）腹腔注射造模，3次/周（周一、周三、周五各1次），共8周。C、D、E組建模同時(shí)按每只大鼠100 g體重分別給予20、10、5 mg姜黃素灌胃（上海三愛(ài)思試劑有限公司分析純），3次/周，共8周；F組建模同時(shí)按每只大鼠100 g給予秋水仙堿（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司）0.01 mg灌胃，1次/d，5次/周（周一、周三、周四、周五、周日各1次），共8周。

1.2.2 取材

8周后處死大鼠，留取大鼠全血，并分離出血清，-7 ℃保存待測(cè)；留取肝左葉浸泡于10%中性甲醛溶液中固定至少24 h待檢。

1.2.3 檢測(cè)方法

比色法檢測(cè)血清活性氧（ROS）水平；鱟試驗(yàn)法檢測(cè)血清內(nèi)毒素；TBA法檢測(cè)肝組織勻漿中丙二醛（MDA）含量；電泳遷移率試驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)肝組織中對(duì)肝組織核因子-kB（NF-kB）的活性，結(jié)果用圖像分析軟件Image Plus進(jìn)行條帶灰度面積分析，計(jì)算NF-kB活性值（灰度值）；免疫組織化學(xué)雙染色檢測(cè)肝組織中NF-kB和肌源性特異性標(biāo)志物結(jié)合蛋白（desmin），確定NF-kB在肝星狀細(xì)胞的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b1（TGF-b1）、血小板衍生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）、CTGF水平；RT-PCR法檢測(cè)肝組織中金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ROS水平

經(jīng)四氯化碳造模后模型組血清ROS水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予姜黃素后，ROS水平下降，且隨著劑量的增大下降趨勢(shì)明顯，其中高劑量姜黃素組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)性組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠血清ROS及內(nèi)毒素水平比較（x ±s）

2.2 血清內(nèi)毒素水平

模型組血清內(nèi)毒素水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同劑量姜黃素組內(nèi)毒素水平明顯下降，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 肝組織MDA含量

模型組MDA含量明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素治療后，MDA均有下降，高劑量姜黃素組與低劑量黃素組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高、中劑量姜黃素組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)性組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.4 肝組織NF-kB活性

姜黃素可降低NF-kB同源序列的結(jié)合活性，且呈劑量依賴性；NF-kB活性（灰度值）檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組活性明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組活性明顯降低，且呈劑量依賴性，高、中劑量姜黃素組組分別與低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠肝組織MDA、NF-kB活性及表達(dá)量化分析（x ±s）

2.5 肝組織NF-kB表達(dá)

正常組NF-kB僅極少量表達(dá)于匯管區(qū)血管壁；模型組可見(jiàn)纖維間隔和匯管區(qū)大量表達(dá)，且呈長(zhǎng)橢圓形或梭形，且著色較深；高劑量姜黃素組僅少量表達(dá)于匯管區(qū)，中劑量姜黃索組和陽(yáng)性組在纖維間隔和匯管區(qū)可見(jiàn)表達(dá)，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量姜黃索組在纖維間隔和匯管區(qū)可見(jiàn)明顯表達(dá)，與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量姜黃素組分別與中、低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.6 肝組織TGF-b1表達(dá)

正常組僅少量表達(dá)于于中央靜脈周?chē)渭?xì)胞；模型組大量表達(dá)于變性的肝細(xì)胞及其周?chē)胃]壁、匯管區(qū)和纖維間隔；隨著姜黃素劑量的增大，表達(dá)量均有下降，不同劑量姜黃素組組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)性組表達(dá)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠肝組織TGF-b1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-l mRNA表達(dá)量化分析（x ±s）

2.7 肝組織PDGF-BB表達(dá)

正常組PDGF-BB僅在門(mén)靜脈血管內(nèi)有少量表達(dá)；模型組在匯管區(qū)間隔內(nèi)細(xì)胞、炎細(xì)胞、竇旁細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，陽(yáng)性染色面積比例明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素治療后表達(dá)明顯減少，主要見(jiàn)于血竇旁、匯管區(qū)，其中高劑量姜黃素組陽(yáng)性面積比例與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組分別與中、低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.8 肝組織TIMP-l mRNA表達(dá)

正常組僅有微量表達(dá)，而模型組表達(dá)量明顯增加，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組與低劑量黃素組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 3）。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑，是肝臟受到各種慢性損傷后發(fā)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是由于膠原和其它細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解失衡，導(dǎo)致在肝內(nèi)過(guò)量沉積[2]。四氯化碳造模過(guò)程中，機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基攻擊肝細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，激活的肝巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）釋放出多種細(xì)胞因子，如使肝星狀細(xì)胞（HSC）活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生大量的ECM，從而導(dǎo)致肝纖維化的形成[3-4]。

姜黃素為中藥姜黃的提取物，毒副作用小，具有廣泛的藥理活性，能清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和調(diào)控基因表達(dá)，是目前抗肝纖維化作用及機(jī)理研究的試驗(yàn)藥物。本研究結(jié)果表明，姜黃素對(duì)血清中ROS和內(nèi)毒素水平及肝組織中MDA、NF-kB、TGF-b1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，且與劑量也有一定的相關(guān)性。其中，內(nèi)毒素可直接產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)和激發(fā)肝星狀細(xì)胞的基因和表型發(fā)生改變，不同劑量姜黃素組內(nèi)毒素水平明顯下降，可延緩肝纖維化的進(jìn)程[5-6]；經(jīng)姜黃素治療后，肝組織中的MDA水平下降，提示姜黃素為良好的抗氧化物質(zhì)，可穩(wěn)定細(xì)胞膜，通過(guò)抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生[7-8]；NF-kB在肝纖維化時(shí)增強(qiáng)活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝損傷和纖維化程度，姜黃素可降低NF-kB同源序列的結(jié)合活性，高劑量姜黃素組僅少量NF-kB表達(dá)于匯管區(qū)，由此表明姜黃素通過(guò)抑制NF-kB的激活而導(dǎo)致抗凋亡作用，進(jìn)而促進(jìn)HSC凋亡[9-10]；經(jīng)姜黃素治療后，肝組織TGF-b1、PDGF-BB表達(dá)明顯減少，提示姜黃素可降低TGF-bl的促纖維化效應(yīng)，從而減緩HSC的激活、增殖[11-12]，下調(diào)PDGF-BB的表達(dá)，降低PDGF與其受體結(jié)合，使PDGF的促增殖效應(yīng)得到有效抑制[13]；各劑量姜黃素組TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低，說(shuō)明姜黃素可抑制TIMP-1的基因表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，減輕肝纖維化程度[14]。

本研究中先采用EMSA技術(shù)以檢測(cè)NF-kB在肝組織中的表達(dá)活性，再用免疫組化雙染色檢測(cè)NF-kB和結(jié)蛋白，以確定其在HSC中的表達(dá)。其中EMSA和免疫組化雙染色是本研究中的兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。再者本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察姜黃素對(duì)肝纖維化的治療作用也是本研究的一個(gè)亮點(diǎn)。

綜上，本研究證實(shí)姜黃素通過(guò)多種機(jī)制治療肝纖維化，具有保護(hù)肝功能、改善肝臟病理學(xué)變化等功效，對(duì)臨床進(jìn)一步應(yīng)用姜黃素抗肝纖維化具有一定的參考價(jià)值，但其在人體內(nèi)的功效有待進(jìn)一步探討。

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