米曲霉固態發酵三七渣產淀粉酶的研究

王 浪， 譚顯東， 胡 偉， 羊依金

（成都信息工程大學資源環境學院，四川成都610225）

三七渣是三七提取皂苷后的廢棄物，目前主要采用露天堆放、焚燒或填埋的方式進行處置，不僅造成了大量生物質資源的浪費，還會帶來二次污染。研究表明，三七渣中富含淀粉、蛋白質、氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等多種營養物質以及三七多糖等生物活性成分（楊智等，1994）。采用三七渣替代常規飼料原料作為固態發酵培養基使用，可以降低生產成本，實現其資源化利用。三七渣經米曲霉發酵后所得的發酵培養物中含有大量的淀粉酶，可以作為飼料添加劑使用。本研究采用單因素試驗和正交試驗對米曲霉固態發酵三七渣產淀粉酶的工藝條件進行了研究和優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉（Aspergillus oryzae），由山東農業大學生命科學學院保藏與提供。

1.1.2 三七渣 三七渣，由四川省某中成藥集團提供，經自然風干、烘干、粉碎、過篩后，置于干燥器中備用。其組成成分的質量分數為：粗淀粉33.13%，粗蛋白質12.28%，真蛋白質9.97%，還原糖1.37%。

1.1.3 培養基 PDA培養基：馬鈴薯浸取液1000mL，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH值自然，121℃滅菌30 min，用于米曲霉的培養和種子液的制備。

三七渣培養基：過60目篩的三七渣10 g，培養基含水率為65%，初始pH自然，培養基于121℃滅菌30 min，用于米曲霉固態發酵產淀粉酶的研究。除特殊說明外，本試驗所用培養基組成均為此。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將在PDA上培養3 d的米曲霉菌種，用滅過菌的無菌水沖洗，制備孢子懸浮液，制備的菌懸液濃度為2×107個/mL。

1.2.2 發酵培養 除特殊說明外，米曲霉發酵培養過程如下：在固態發酵培養基中，接入10%的米曲霉孢子菌懸浮液 （即在10.0 g三七渣固態發酵培養基中接入1 mL菌懸浮液，即為10%的接種量，下同），將其置于PYX-280M-C霉菌培養箱中恒溫培養，培養溫度為30℃，培養時間為5 d。

1.2.3 酶液的制備 稱取1.000 g發酵培養物（濕物料）于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水并充分攪拌使其均勻懸浮，再將其放入40℃的恒溫水浴鍋中浸提60 min后，用8層紗布過濾上述提取液，再將濾液經5000 r/min離心10 min后取其上清液置于4℃下保存，備用。

1.2.4 淀粉酶活的測定 淀粉酶活的測定參照芶琳和單志（2010）的方法。

酶活單位定義為：在試驗條件下，5 min內降解1 mg/mL的淀粉溶液生成1 μmol還原糖需要的酶量，定義為1個酶活單位，記為U/g濕物料。

1.2.5 單因素試驗 分別考察氮源添加量、初始含水量、培養時間、三七渣粒徑對產淀粉酶的影響。

1.2.6 正交試驗 選取培養時間、三七渣粒徑和含水率3個因素，進行L9（33）正交試驗。

本次研究中每個試驗結果均為3個平行試驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 硫酸銨添加量對產淀粉酶的影響 在三七渣基質中按照一定比例（0%～5%）添加硫酸銨，考察氮源添加量對產酶的影響，結果見圖1。

圖1 硫酸銨添加量對產淀粉酶的影響

由圖1可見，不添加硫酸銨時發酵培養物的淀粉酶活最高，隨著硫酸銨添加量的增加，淀粉酶活反而逐漸減小，最終趨于平穩，這說明三七渣中主要營養成分比較均衡，其碳氮比合適淀粉酶的生產。Swetha等（2007）采用米曲霉固態發酵工農業廢料產淀粉酶，結果發現，添加氮源并未促進淀粉酶的增加，與本試驗結果類似。但胡偉等（2013）卻發現采用黑曲霉發酵三七渣產淀粉酶，適量添加氮源（40～60 mg硫酸銨/g干藥渣）有利于淀粉酶的生產。

2.1.2 三七渣粒徑對產淀粉酶的影響 分別采用過 20、40、60、80、100、120 目篩的三七渣作為發酵基質，考察三七渣粒徑對產淀粉酶的影響，結果見圖2。

圖2 三七渣粒徑對產淀粉酶的影響

從圖2可見，采用過80目篩的三七渣作為發酵基質，發酵培養物的淀粉酶活最高。基質顆粒過大或過小都會影響產酶：小的物料顆粒可以提供較大的微生物生長面積，從而提高反應速率，但是顆粒太小又容易導致物料結塊和孔隙率降低，增大傳熱和傳質阻力，影響微生物的呼吸，進而影響微生物生長和產酶；大顆粒物料由于存在較大的孔隙率有利于提高傳質、傳熱效率，但是只能提供較小的微生物生長面積 （Krishna和Chandrasekaran，1996；Frantisek 和 Anil，1995）。

2.1.3 含水率對產淀粉酶的影響 初始含水率對于微生物的增殖和酶的產生是一個重要的因素，含水率過高或者過低都會影響固態發酵產酶量（Pengthamkeerati等，2012）。 含水率過低，影響營養物質的溶解與傳輸；含水率過高，則易使物料結塊，阻礙氣體和熱量的擴散和傳輸，都不利于菌體的生長（張福元和陳風風，2008）。本次研究考察了培養基初始含水率為50%～75%時對產淀粉酶的影響，結果見圖3。

圖3 含水率對產淀粉酶的影響

由圖3可見，當培養基的初始含水率為50%～65%時，淀粉酶活隨初始含水率的增大而增大。當初始含水率達到65%時，淀粉酶活達到最大（114.4 U/g），此后隨著含水率的增加，酶活逐漸下降。采用黑曲霉固態發酵三七渣時，在水含量為55%時，淀粉酶活力就能達到最高 （胡偉等，2013），而 Suhad 等（2011）研究表明固體基質的含水率為40%～70%時有利于米曲霉產淀粉酶，這說明不同的基質和微生物對發酵培養基初始含水率的要求是有差別的。

2.1.4 培養時間對產淀粉酶的影響 從圖4可以看出，發酵培養3 d后淀粉酶活達到最高（113.94 U/g），之后酶活又有所下降，其酶活達到峰值的時間比采用黑曲霉單菌或黑曲霉/產朊假絲酵母混菌發酵三七渣時提前了很多，后兩者淀粉酶活達到峰值的時間分別為168 h和216 h（譚顯東等，2014；胡偉等，2013）；而采用麥麩或木薯渣和生物污泥的混合物作為培養基質固態發酵產淀粉酶的最適培養時間分別為5 d和2 d（Farid和Shata，2011；Pengthamkeerati等，2012）。 這也說明，發酵基質和微生物的種類對淀粉酶活到達峰值的時間影響較大。

圖4 培養時間對產淀粉酶的影響

2.2 正交試驗 為了獲得最優的培養工藝條件，本次研究采用L9（33）正交試驗進行相關條件的優化。正交試驗因素與水平見表1，試驗結果與方差分析分別見表2和表3。

由表3可以看出，含水率、粒徑、培養時間以及三者之間的交互作用對試驗結果的影響均極顯著（P＜0.01），這三個因素以及它們之間的交互作用對試驗結果影響程度的排序為：培養時間＞含水率＞粒徑＞交互作用。由于所考察的三個因素之間的交互作用顯著，因而需進行多重比較才能獲得最優試驗條件組合。多重分析結果見表4。

表1 因素與水平

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

表4 正交試驗多重比較結果

由表4可以看出，試驗1和試驗6的結果最優，兩者之間無顯著差異，考慮到生產成本，較優的工藝條件搭配為試驗1（A1B1C1）。在此條件下，米曲霉固態發酵三七渣所得發酵培養物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料，優于黑曲霉發酵的結果（胡偉等，2013）。

3 結論

3.1 含水率、粒徑、培養時間以及三者之間的交互作用對試驗結果的影響均極顯著 （P＜0.01），這三個因素以及它們之間的交互作用對試驗結果影響程度的排序為：培養時間＞含水率＞粒徑＞交互作用。

3.2 在優化的工藝條件下，即采用過60目篩的三七渣，培養基初始含水率60%，培養時間2 d，接種量10%，米曲霉固態發酵三七渣所得發酵培養物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料。

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