一種草魚細菌病病原的分離鑒定

鄧威

摘 要：天津市寧河縣某淡水養殖池塘發生了一起草魚細菌性疾病。患病草魚出現腹部充血，腹腔積水和肝臟發白等癥狀。從患病草魚肝臟中分離到PA001和PA002兩個菌株，通過回感試驗證明這兩個菌株可能為引發該疾病的病原菌，經鑒定為銅綠假單胞菌。根據藥物敏感性試驗結果，采用口服氟苯尼考的方法進行治療，取得了較好的效果。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；感染；草魚；鑒定

中圖分類號：S941 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.014

Identification and Isolation of Bacterial Pathogens from Bacterial Disease of Grass Carp

DENG Wei

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals， Tianjin 300221，China）

Abstract： An epizootic was discovered in grass carp （Ctenopharyngodonidellus） in earthen ponds in Ninghe. The diseased fish presented with hemorrhaging in the abdominal wall， ascites in the abdomen and pale liver. Strains named PA001 and PA002 were isolated from the moribund fish， and were identified as Pseudomonas aeruginosa according to biochemical tests. The pathogenicity of PA001 was confirmed by infectivity experiments. According to the result of antimicrobial susceptibility testing， florfenicol were used by oral administration， and the result showed that it was an effective measure to control the disease.

Key words： Pseudomonas aeruginosa； infection； grass carp； identification

假單胞菌是魚類“赤皮病”的病原菌，該病對淡水養殖魚類危害嚴重，常引起較大的經濟損失[1]。在假單胞菌屬之中，熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、綠針假單胞菌和變形假單胞菌都能導致魚類的病害發生[2-5]。然而，有關銅綠假單胞菌能引發魚類疾病的報道卻很少見，盡管其常作為一種人類病原被報道。本研究報道了一例由銅綠假單胞菌引發的草魚疾病。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離

2013年5月8日，10尾患病草魚從天津市寧河縣某養殖場送至本實驗室進行診斷。通過鏡檢草魚的鰓和體表，未發現大量的寄生蟲。在無菌操作下，從瀕死草魚的腎臟、肝臟和脾臟取樣，在LB培養平板上分離病原菌，28 °C培養24 h 后，選取優勢菌落進一步分離純化，分離得到兩株優勢菌株PA001和PA002。

1.2 細菌的鑒定

菌株PA001和PA002的形態、生理生化特性按文獻[6]的方法進行鑒定。同時利用法國梅里埃公司的半自動細菌鑒定儀對菌株進行鑒定。

1.3 人工感染試驗

試驗草魚由天津市換新良種場提供，共60尾，體長（12±2.1） cm。草魚飼養于50 L的圓形塑料桶中，充氣，每天按體質量的2%投喂膨化飼料，上下午各投喂1次。暫養2周，確認無病后，開始試驗。將PA001用LB培養基培養，5 000 g離心集菌，用PBS洗滌3次后，用麥氏比濁法將菌液濃度調整為1.0×107 CFU·mL-1，腹腔注射草魚0.2 mL，對照組注射同樣劑量的PBS，連續觀察2周。

1.4 藥敏試驗

28 °C培養過夜的PA001用PBS調整濃度至1×108 CFU·mL-1，取100 μL涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板，然后將藥敏紙片（購于杭州微生物公司）貼在平板上，28 °C培養24 h 后測定抑菌直徑，按照產品說明書判斷敏感度。

2 結果與分析

2.1 病原菌的鑒定

PA001和PA002呈現相同的生理生化特征，為革蘭氏陰性桿菌，具有運動性，不產生孢子。在LB平板上28 °C培養48 h后，菌落成圓形，濕潤，邊緣整齊，不透明，淡黃色，菌落直徑約為2～2.5 mm。同時，在血平板上，兩株細菌都具有β溶血，其他生化反應與銅綠假單胞菌ATCC 27853株具有相同的結果（表1），因此，根據常規生理生化測試可初步判定為銅綠假單胞菌。

利用ATB鑒定系統對PA001和PA002進行鑒定，兩株細菌顯示完全相同的鑒定結果，都顯示為銅綠假單胞菌（表2）。

2.2 人工感染試驗

試驗組草魚在感染后第5天出現死亡，至14 d，累計死亡率為67%。人工感染后試驗魚表現為活動減弱，腹部充血，腹腔有積水，個別死亡魚眼球突出。死魚解剖檢查，可見肝臟發白，同自然發病的癥狀基本相似，對照組不表現任何癥狀。從感染后的病魚肝臟中再次分離細菌，用優勢菌PA001-1再次感染草魚，得到相同的結果。

2.3 藥敏試驗

根據菌株PA001對12種藥物的藥敏試驗結果，該菌株對妥布霉素、四環素和氟苯尼考等3種抗生素敏感，對鏈霉素、氯霉素和慶大霉素等3種抗生素中度敏感，對諾氟沙星、氨芐青霉素、紅霉素、羅紅霉素、卡拉霉素和萬古霉素等6種抗生素顯示出耐藥（表3）。

3 結論與討論

草魚是我國的四大家魚之一，年產量達229.7萬t[7]。然而，由于集約化程度和養殖密度的不斷提高，草魚病害也日漸增多。據報道，熒光假單胞菌[5]、柱狀黃桿菌[8]、嗜水氣單胞菌[9]、霍亂弧菌[6]和擬態弧菌[6]都曾引起草原細菌性病害的暴發。本試驗中，銅綠假單胞菌從患病草魚肝臟中被分離到，且通過攻毒試驗證明其對草魚的致病性，這說明銅綠假單胞菌是引起此次草魚疾病的病原。然而，由于能對嗜水氣單胞菌產生拮抗作用，為了控制嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血癥，銅綠假單胞被作為一種益生素用于鯪魚的養殖。由于銅綠假單胞菌對草魚的致病性，它作為益生素使用的安全性應給予高度的重視。

此次疾病流行了1個月，導致了超過30%的草魚死亡，根據藥物敏感性的試驗結果，利用口服氟苯尼考（每尾魚25 mg·kg-1·d-1）的方法對草魚進行治療，3 d后病害得到控制，1周后草魚停止死亡，這表明藥物敏感性試驗在治療藥物篩選過程中具有很強的實際意義。所以，在今后的生產實踐中，應根據藥物敏感性試驗結果，做到科學合理地選擇和使用藥物。

參考文獻：

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