乳酸菌的分離及酸奶制備

尹瓊等

【摘 要】從市售酸奶中分離并鑒定了保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococus thermophilus）。將分離出的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以2：1的比例加入牛奶中42℃進行發酵，用考馬斯亮藍G250法測定發酵前后蛋白質含量，結果表明：蛋白質含量呈增加趨勢，但仍然小于發酵前蛋白質含量，單菌發酵的蛋白質含量高于雙菌的蛋白質含量。

【關鍵詞】發酵；蛋白質含量測定；保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌

0 引言

酸奶一般是指殺菌乳在有益菌（如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的作用下進行發酵所得到的乳制品。發酵完成之后，乳制品中大量存在有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。經過巴氏殺菌后再向牛奶中添加有益菌（發酵劑），經發酵后冷卻灌裝的一種牛奶制品。最常用的酸奶發酵菌種是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermophilus）這兩類乳酸菌。牛奶中含有很多乳糖和蛋白質，酸奶在發酵的過程中會將乳糖分解，產生乳酸導致溶液的pH值逐漸下降，使酪蛋白聚集沉降，從而形成半固體狀態的凝膠體物質。本研究將從市售酸奶產品中分離到保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌，研究凝固型酸奶的制作方法，用不同菌種發酵鮮奶，測定產品中蛋白質含量，研究酸奶發酵的規律。

材料與方法：

1 儀器與試劑

化學試劑：檸檬酸二胺，磷酸氫二鉀，MgSO4·7H2O ，MnSO4·4H2O，氯化鈉，乙酸鈉，均為分析純。

生物試劑：牛血清白蛋白，胰蛋白胨，酵母提取物，溴甲酚紫，草酸銨結晶紫染液，盧戈氏碘液，番紅染液，七葉苷，阿拉伯糖，麥芽糖，棉子糖，纖維二糖，精氨酸。

材料：光明暢優酸奶（產品標準號 GB 19302，生產許可證號QS 4201 0501 0223），蒙牛純牛奶（GB 19302）。

儀器：超凈工作臺（上海博訊），培養箱（上海新苗），光學顯微鏡（南京舜宇），高壓滅菌鍋（上海華線核醫），可見光分光光度計（上海尤尼柯）。

2 實驗方法

2.1 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的分離純化與鑒定，按照文獻[1-3]中的方法進行。

2.2 接種發酵

稱取5g的奶粉，溶解于100ml蒸餾水中。分裝到100ml的錐形瓶中中，25ml一瓶，95℃滅菌5min。取已經分離出的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌液各200ul于5ml的滅過菌的鮮牛奶中，42℃培養箱中發酵。

2.3 蛋白質含量測定

分別配制濃度為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/ml的標準蛋白溶液，用考馬斯亮藍G-250[4]， 于595nm處測定各管吸光值，繪制工作曲線。然后測定自制酸奶蛋白質含量。

3 結果與討論

3.1 乳酸菌的分離純化與鑒定

市售酸奶的各稀釋度樣品液中，10-3，10-4，10-5稀釋度得到單菌落的效果較好，鏡檢[5]觀察可知，保加利亞乳桿菌菌落較大，米白色，表面不光滑，單個體呈長桿狀或成鏈，兩端鈍圓，為厭氧菌，革蘭氏染色為陽性；嗜熱鏈球菌菌落小，卵圓形，乳白色，呈對或鏈狀排列，革蘭氏染色也為陽性[6]。進一步的糖發酵實驗與生理生化鑒定結果如表1、表2所示。

3.2 酸奶的發酵和蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法作牛血清白蛋白的工作曲線，測定在595nm處的吸光值，結果如圖1所示。吸光度y與蛋白質濃度x（mg/ml）之間的關系式為y=6.88874x+0.08864，R=0.97887，用圖1的標準曲線計算自制酸奶里的蛋白質濃度。

將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和混合雙菌分別進行酸奶發酵，測定不同時間產品的蛋白質含量，結果如圖2和表3所示：

用分離的菌種進行酸奶發酵的結果表明，發酵之后的蛋白質含量比發酵之前高，但是按照理論推斷，牛奶在經過乳酸菌發酵，乳酸菌為了增殖是會分解牛奶中的蛋白質的，所以蛋白質含量應該是下降的。現在推斷有兩個方面的原因。（1）牛奶中的蛋白質雖然被分解了，但是進入細胞中是需要一個過程的，這個時候大分子蛋白質被分解為小分子蛋白質或者多個分子質量較大的多肽，而在測定蛋白質含量的時候，這些物質并未進入胞內，造成了蛋白質含量增高的假象；（2）發酵終點時，酪蛋白大量沉淀，造成在稀釋樣品時存在懸浮液，而染料與懸浮液的結合可能會導致蛋白質含量的測定結果偏高。

4 結論

從市售酸奶中分離純化了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，嗜熱鏈球菌菌落小，成乳白色，保加利亞乳桿菌菌落較大，呈米白色，表面不光滑。對分離的菌種進行了鑒定，所分離的嗜熱鏈球菌不能在pH9.6、6.5%NaCl條件下生長，不從精氨酸產氨，且麥芽糖、蔗糖、棉子糖發酵為陰性；所分離的保加利亞乳桿菌不從精氨酸產氨，乳糖發酵為陽性，而阿拉伯糖、麥芽糖、七葉苷、蔗糖、棉子糖、纖維二糖、核糖發酵均為陰性。所有這些檢測標準均符合伯杰氏手冊中對這兩種菌的描述，因此判斷分離菌種正確。用雙菌混合發酵制作酸奶，測定了發酵過程中蛋白質的含量變化，結果表明，隨著發酵時間的遞增，酸奶中的蛋白質含量在發酵的初始階段呈現先上升后下降的趨勢，酸奶發酵的時間在6h之后蛋白質含量持續下降。混合菌種發酵對蛋白質的消耗明顯高于單菌種。發酵完成后，蛋白質含量比發酵前要低。

【參考文獻】

[1]徐松斌，李威娜.酸奶中保加利亞乳桿菌的分離和鑒定[J].刊名中國乳品工業，2003，31（3）：16-17.

[2]王建芳，陳芳.嗜熱鏈球菌適宜培養條件研究[N].西北農業學報，2008，17（2）：56-58.

[3]佟瀟.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和鑒定[J].中國乳品工業，2004，32（3）：26-27.

[4]孫士青，王少杰，等.考馬斯亮藍法快速測定乳品中蛋白質含量[J].山東科學，2011，24（6）：53-55.

[5]沈萍，陳向東.微生物實驗[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[6]R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社.

[責任編輯：劉展]