知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*

魏靜娜，劉征輝，趙琳琳，郭永澤，程　奕，溫春秀

（1.天津海世達檢測技術有限公司，天津300381；2.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津300381；3.河北省農林科學院經濟作物研究所，石家莊050051）

·中藥研究·

知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*

魏靜娜1，劉征輝1，趙琳琳1，郭永澤2，程奕2，溫春秀3

（1.天津海世達檢測技術有限公司，天津300381；2.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津300381；3.河北省農林科學院經濟作物研究所，石家莊050051）

［目的］建立知母藥材的高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器-蒸發光散射檢測器聯用（HPLC/PDA/ELSD）指紋圖譜。［方法］采用Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸，梯度洗脫流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長258 nm，ELSD檢測器載氣氣壓30 Psi，漂移管溫度80℃。［結果］建立了知母的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜，在HPLC-PDA色譜圖中標定了17個共有峰，HPLC-ELSD色譜圖中標定了14個共有峰。［結論］該方法重復性好，可用于知母藥材的全面質量控制。

知母；指紋圖譜；HPLC/PDA/ELSD

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根莖，主產于河北、山西及山東等地。春、秋兩季采挖，除去須根及泥沙，曬干，或除去外皮，曬干。切片入藥，生用，或鹽水炙用。現代藥理研究表明，知母具有抗炎［1-4］、降血糖［5-8］、抗阿爾茨海默病［9-12］等作用，臨床應用安全可靠，毒副作用小［13］。在知母藥材的全面質量控制方面，目前文獻報道的，多為采用紫外檢測器或者蒸發光散射檢測器得到的一維圖譜［14-15］，文章采用二級管陣列/蒸發光散射（PDA/ELSD）兩種檢測器串聯的方式，對河北省不同栽培區域的知母藥材指紋圖譜進行研究，得到了更加全面的知母藥材質量控制方案。

1　儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀（配有Waters2996 PDA檢測器，Waters2424 ELSD檢測器，Empower2色譜工作站），分析天平（METTLERXS205，METTLER AB54），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

芒果苷（111607-200402，購自中國藥品生物制品檢定所），新芒果苷（X-032-140602，純度≥98%，購自成都瑞芬思科技有限公司），知母皂苷BII（111839-201102，純度90.8%，購自中國藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純，Merck公司），冰乙酸（色譜純，天津康科德科技有限公司），乙醇（分析純，天津風船化學試劑科技有限公司）。

知母藥材來源見表1，經河北省農林科學院經濟作物研究所溫春秀研究員鑒定為百合科植物知母。

表1　知母藥材來源Tab.1Origins of Rhizoma Anemarrhenae

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～18%A；10～15 min，18%～25%A；15～25 min，25%A；25～50 min，25%～100%A；50～55 min，100%A；55～60 min，100%～5%A；60～75 min，5%A；流速：1.0 mL/min。PDA檢測器檢測波長：258 nm，ELSD檢測器：氮氣壓力30Psi，漂移管溫度80℃，進樣體積：20μL。

2.2對照品溶液的制備精密稱取新芒果苷，芒果苷，知母皂苷BII，加70%乙醇，制成每mL含0.10 mg的混合標準溶液。

2.3供試品溶液的制備取干燥的知母藥材粉末（過60目篩）0.5 g，精密稱定，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，用70%的乙醇補足減失的重量，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.4方法學考察

2.4.1穩定性實驗取1號知母藥材粉末，精密稱定，按照“2.3”項下的方法，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h檢測指紋圖譜。主要共有峰保留時間及峰面積比值的RSD值分別為0.05%～0.031%，0.06%～0.013%（PDA色譜圖中的主要共有峰），1.1%～1.8%（ELSD色譜圖中的主要共有峰），表明供試品溶液在48 h內穩定。同時發現50 min后，色譜圖中再沒有特征峰出現，色譜記錄時間50 min即可。

2.4.2精密度實驗取“2.2”項下的混合標準溶液，按照“2.1”項下的色譜條件連續進樣6次，各色譜峰的峰面積比值RSD均小于3%，表明精密度良好，儀器很穩定。

2.4.3重復性實驗取1號樣品，按照“2.3”項下的供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進樣，PDA色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為0.15%～0.39%，ELSD色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為1.1%～2.8%，表明本方法重復性良好。

2.5指紋圖譜的建立根據11批供試品溶液HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜所給出的峰數、峰值和峰位等相關參數，進行比較分析，得到圖1-2所示的指紋圖譜共有模式圖。

圖1　11批知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜共有模式圖Fig.1Mutual mode of HPLC-PDA fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

圖2　11批知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式圖Fig.2Mutual mode of HPLC-ELSD fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

2.6指紋圖譜分析與評價

2.6.1共有峰的確定根據11批供試品溶液所得測試結果，確定HPLC-PDA指紋圖譜有17個峰為各批樣品所共有，同法確定了HPLC-ELSD指紋圖譜中的14個共有峰。見圖3-4。

圖3　知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜Fig.3HPLC-PDA fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

圖4　知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig.4HPLC-ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

2.6.2參比峰的選擇在各批次樣品的HPLCPDA圖譜中，芒果苷的峰面積較大，較穩定，所以選取芒果苷的峰（9號峰）為HPLC-PDA圖譜的參照峰；同理選取知母皂苷BII的峰（5號峰）作為HPLC-ELSD圖譜的參照峰。

2.6.3指紋圖譜的相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對各批知母藥材的指紋圖譜進行數據處理，生成對照圖譜，計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度，只有10號樣品的PDA圖譜與對照圖譜的相似度在0.9以下，其他都在0.9以上。見表2。

表2　知母指紋圖譜相似度評價結果Tab.2Similarity analysis of Rhizoma Anemarrhenae fingerprint

3　討論

3.1檢測器的選擇知母中的主要化學成分有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、多糖類、木脂素類等［16-17］，如果單純使用PDA檢測器，由于甾體皂苷類成分沒有紫外吸收，所以，此類成分的含量將無法控制，而ELSD檢測器作為通用型檢測器，雖然理論上，只要待測物質的沸點高于流動相，就可以使用ELSD檢測器檢出，但由于靈敏度低，所以，單純使用ELSD檢測器建立的指紋圖譜中，會缺少一些含量較低的物質的信息。本實驗采用HPLC/PDA/ELSD聯用的方式，建立了知母藥材的多維指紋圖譜，彌補了采用單一檢測器的局限性，可以更立體的控制知母藥材的質量［18-19］。

3.2檢測波長的選擇實驗采用3D數據采集，記錄了供試品溶液在190～400 nm的全波長色譜圖，在不同的波長下提取色譜圖，當波長低于260 nm時，基線不平，而波長大于260 nm時，各主要色譜峰的吸收又會降低，所以，選取了芒果苷的最大吸收波長258 nm為檢測波長。

3.3流動相系統的選擇實驗考察了乙腈-冰醋酸水溶液和乙腈-甲酸水溶液兩個流動相系統，發現使用乙腈-冰醋酸水溶液，各峰的分離度更好，出峰時間分布更均勻，因此，最終選用了乙腈-冰醋酸水溶液作為流動相。

3.4色譜柱的選擇實驗考察了Waters SunFireTMC18、Waters Symmetry C18、Waters Symmetry ShieldTMRP C18和Dikma Diamonsil C18，結果表明，使用Waters Symmetry ShieldTMRP C18時，各峰分布更均勻，分離度更好，所以采用此色譜柱。

郭曉曄等［20］的研究揭示了栽培“西陵知母”中不同化學成分在一年中的各月份，呈現不同的規律性變化。實驗使用的藥材均采收于初秋8、9月份，采收于其他季節的知母藥材，可能會由于其中某些化學成分的含量處于不同時期，而與本實驗建立的對照指紋圖譜相似度較低。

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［2］劉蕓，鄭瑞.知母醇/水提取物對α-淀粉酶抑制作用研究［J］.陜西中醫，2013，34（7）：897-898.

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［4］劉卓，隋海娟，閆恩志，等.知母皂苷對脂多糖誘導巨噬細胞炎癥介質釋放影響［J］.中國公共衛生，2013，29（3）：384-386.

［5］李學堅，杜正彩，鄧家剛，等.芒果苷酰化衍生物降血糖活性的研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（1）：51-53.

［6］馬潔桃，張嶺，來偉旗，等.芒果苷對L6細胞葡萄糖消耗的影響及其作用機制研究［J］.中國預防醫學雜志，2012，13（9）：662-666.

［7］馬河，劉園華，張金杰.知母水溶性小分子提取物對胰島素抵抗HepG2細胞體外糖代謝的影響［J］.食品與藥品，2013，15（1）：26-28.

［8］肖復茜，李洪秀，隋海娟，等.知母皂苷元對高糖引起的體外培養大鼠海馬神經元損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2013，29（1）：107-112.

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［20］郭曉曄，楊東升，周冠月，等.“西陵知母”有效成分動態積累研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（1）：74-75.

（本文編輯：高杉，于春泉）

Study on HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

WEI Jing-na1，LIU Zheng-hui1，ZHAO Lin-lin1，GUO Yong-ze2，CHENG Yi2，WEN Chun-xiu3
（1．Tianjin High-Standard Quality Testing Lab，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300381，China；3.Institute of Cash Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050051，China）

［Objective］To establish the HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae.［Methods］This experiment had been done on Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）analytical column of 30℃，with a gradient eluted acetonitrile-0.1% acetic acid mobile phase system of 1.0 mL/min.The detection wavelength had been set at 258 nm，N2pressure was 30 Psi，and the temperature of the drift tube was 80℃.［Results］The mutual modes of the HPLC/PDA/ELSD fingerprint were set up under the established condition.The 17 mutual peaks in the HPLC-PDA fingerprint and 14 mutual peaks in the HPLC-ELSD fingerprint of 11 samples were confirmed.［Conclusion］The method that had been established in this experiment is a good method to totally control the quality of Rhizoma Anemarrhenae.

Rhizoma Anemarrhenae；fingerprint；HPLC/PDA/ELSD

R284.1

A

1672-1519（2015）10-0618-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.10

“十二五”科技部國家科技支撐計劃項目（2011B A107B064）。

魏靜娜（1981-），女，碩士，工程師，研究方向為藥品質量分析。

程奕，E-mail：cychengyi@yahoo.com。

（2015-04-27）