納米銅粉對(duì)中肋骨條藻的毒性效應(yīng)

李芳芳,潘 容,張 偲,王江濤（中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266100）

納米銅粉對(duì)中肋骨條藻的毒性效應(yīng)

李芳芳,潘 容,張 偲,王江濤*（中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266100）

以中肋骨條藻作為受試藻種,研究銅離子、納米銅和微米銅對(duì)它的毒性效應(yīng).結(jié)果表明,3種銅試劑在不同程度上都會(huì)抑制中肋骨條藻的生長(zhǎng),藻密度和葉綠素的增加值與銅試劑加入量基本呈負(fù)相關(guān).在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期96h內(nèi),當(dāng)Cu2+濃度大于0.1mg/L時(shí)會(huì)對(duì)藻產(chǎn)生很大的抑制作用,而納米銅濃度大于0.15mg/L會(huì)嚴(yán)重影響藻密度和葉綠素,在24h內(nèi)當(dāng)微米銅濃度低于2mg/L時(shí)會(huì)促進(jìn)藻的生長(zhǎng),在96h時(shí)高濃度（＞1mg/L）會(huì)抑制其生長(zhǎng).納米銅對(duì)中肋骨條藻的毒性作用一方面是溶出的銅離子,另一方面是納米粒子本身.

納米銅；微米銅；Cu2+；中肋骨條藻

研究表明,重金屬納米材料會(huì)對(duì)生物造成毒性,進(jìn)而通過(guò)食物鏈對(duì)人體產(chǎn)生危害［1］.納米銅在水環(huán)境中檢出率較高,而且當(dāng)藻暴露在幾種重金屬中時(shí),發(fā)現(xiàn)銅的致毒作用最強(qiáng)［2］.

浮游植物是水生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生產(chǎn)者.由于藻類(lèi)繁殖速度快,并且可以在細(xì)胞水平上直接觀(guān)察它的中毒癥狀［3］,所以許多國(guó)家已經(jīng)把藻作為檢測(cè)污染物的實(shí)驗(yàn)生物.中肋骨條藻是我國(guó)沿海常見(jiàn)硅藻,是很多經(jīng)濟(jì)動(dòng)物幼體的優(yōu)質(zhì)餌料生物［4］.目前,雖然已有不少研究進(jìn)行了納米材料對(duì)動(dòng)物的毒性探究,如劉紅云［5］的納米氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的研究.但納米材料對(duì)微藻的毒性研究還少見(jiàn)報(bào)道,尤其是納米金屬.本實(shí)驗(yàn)研究納米銅對(duì)中肋骨條藻的毒性作用,旨在為納米材料的安全性評(píng)價(jià)提供參考.

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：光照培養(yǎng)箱（GXZ型智能光照培養(yǎng)箱）,顯微鏡（DM4000B型智能顯微鏡,）,高壓滅菌鍋（LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器）,bbe藻類(lèi)分析儀（UV2550bbe Moldaenke,）.

試劑：納米銅粉（純度＞99.9%,10～30nm）,微米銅粉（純度＞99.9%,325目）,五水硫酸銅（純度＞99.0% 分析純）.

1.2實(shí)驗(yàn)材料

中肋骨條藻取自中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室藻種室.海水取自青島近岸海域,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后加入錐形瓶中,在120℃高溫高壓下滅菌20min,室溫冷卻,加入f/2培養(yǎng)液（不加微量元素）,隨后加入藻液放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為（20±1）℃,光照采用冷白光源,光照度 4000lux,光暗比為 12h：12h.每天定時(shí)取樣,顯微鏡計(jì)數(shù)待其長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1納米銅、微米銅及 Cu2+對(duì)中肋骨條藻的毒性實(shí)驗(yàn) 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的中肋骨條藻分別接種到57個(gè)250mL的錐形瓶中,使初始藻密度為4.8×105cell/mL,然后加入分散良好的3種銅試劑.培養(yǎng)周期為96h,每天定時(shí)取樣,取樣后搖晃培養(yǎng)瓶以增加二氧化碳溶解量,并重新隨機(jī)放置培養(yǎng)瓶,以排除光或溫度不同造成的影響.每天在光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用bbe藻體分析儀測(cè)藻活體的葉綠素?zé)晒?在測(cè)定葉綠素之前,需要暗適應(yīng) 20min.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將本次的實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為：納米銅和 Cu2+為 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/L,微米銅為0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5mg/L,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù).

1.3.2藻液中Cu2+的測(cè)定 將生長(zhǎng)到96h的加入不同銅試劑的藻液經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾,然后用階梯掃描溶出伏安法測(cè)定游離的銅離子濃度［6］.

1.3.3濾液中Cu2+的測(cè)定 將生長(zhǎng)到96h的藻液過(guò)濾,然后在濾液中加入和實(shí)驗(yàn)組相同濃度的Cu2+,測(cè)定游離的銅離子濃度.

1.3.4數(shù)據(jù)分析 采用下式（1）計(jì)算每一天生物量的相對(duì)抑制率（IR）［7］：

式中：IR為相對(duì)抑制率,T為實(shí)驗(yàn)組生物量,C為對(duì)照組生物量.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）來(lái)表示,并用Origin9.0軟件繪圖.采用SPSS16.0軟件對(duì)藻密度和葉綠素?zé)晒膺M(jìn)行差異性分析.各組間的顯著性差異用one-way ANOVA進(jìn)行分析［8］. P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn).

2　結(jié)果與討論

2.1不同形態(tài)的銅對(duì)中肋骨條藻藻密度的影響

圖1　不同形態(tài)和濃度銅試劑對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞密度的影響Fig.4　Cell density of S. costatum under different form and amounts of copper reagents

由圖1可以看出,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,當(dāng)Cu2+濃度大于 0.1mg/L時(shí),中肋骨條藻會(huì)受到較大程度的抑制（P＜0.05）.當(dāng) Cu2+濃度小于 0.05mg/L 時(shí),0～24h內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的藻密度和對(duì)照組相差不大（P＞0.05）,但在24～96h內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的藻密度明顯低于對(duì)照組,中肋骨條藻受到明顯抑制（P＜0.05）（圖1a）.同樣,當(dāng)納米銅濃度大于0.15mg/L時(shí),中肋骨條藻會(huì)受到較大程度的抑制（P＜0.05）.當(dāng)納米銅濃度小于 0.1mg/L時(shí),中肋骨條藻同樣會(huì)受到抑制,但此時(shí)的抑制程度小于相同濃度的 Cu2+實(shí)驗(yàn)組（圖1b）.當(dāng)微米銅濃度小于2mg/L時(shí),在24h內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的藻密度大于對(duì)照組藻密度,在96h時(shí)只有當(dāng)微米銅濃度大于1mg/L才會(huì)和對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）,并且這種抑制性明顯低于Cu2+和納米銅（圖1c）.

圖2　不同形態(tài)和濃度銅試劑對(duì)中肋骨條藻葉綠素含量的影響Fig.4　Chlorophyll of S. costatum under different form and concentration of copper reagents a：銅離子 b：納米銅 c：微米銅

2.2不同形態(tài)的銅對(duì)中肋骨條藻葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

如圖2所示,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中中肋骨條藻的葉綠素?zé)晒馀c藻密度變化的趨勢(shì)大體一致.整體而言,相同濃度下微米銅對(duì)中肋骨條藻的毒性低于 Cu2+和納米銅,只有當(dāng)微米銅的濃度大于2mg/L時(shí)才會(huì)產(chǎn)生比較明顯的抑制效應(yīng).納米銅的毒性較大,僅次于Cu2+,當(dāng)其濃度大于0.15mg/L時(shí)就會(huì)對(duì)藻產(chǎn)生較大的毒性（P＜0.05）.

2.3不同實(shí)驗(yàn)組的中肋骨條藻的抑制率及 96h的半效應(yīng)濃度EC50

如圖 3所示,在 96h內(nèi)當(dāng)納米銅濃度為0.05mg/L時(shí),相對(duì)抑制率比其它濃度組明顯要低,并且和Cu2+濃度為0.05mg/L時(shí)的相對(duì)抑制率相差不是很大.在 24h之內(nèi)當(dāng)微米銅的濃度小于1mg/L時(shí)對(duì)藻的抑制率是負(fù)值, 說(shuō)明在24h這個(gè)濃度的微米銅對(duì)藻起到促進(jìn)作用,這可能是因?yàn)榇藭r(shí)微米銅溶出的離子濃度較低,有研究表明,銅、鋅和錳屬于過(guò)渡金屬,低濃度下,可作為酶的輔助因子促進(jìn)藻類(lèi)的光合作用,從而促進(jìn)其生長(zhǎng)［9］.在72～96h內(nèi)當(dāng)微米銅濃度大于2mg/L時(shí)對(duì)藻的抑制率才較大.

3種銅試劑對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用,并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.按現(xiàn)有方法［10］將抑制百分?jǐn)?shù)對(duì)濃度對(duì)數(shù)進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸,得到不同銅試劑對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)劑量-效應(yīng)方程和96h EC50值（圖4）.由圖4可以看出,納米銅對(duì)中肋骨條藻的 EC50值大于微米銅,小于銅離子.這說(shuō)明納米銅對(duì)中肋骨條藻的抑制作用大于微米銅,而小于銅離子.

2.496h時(shí)不同粒徑銅的溶出離子濃度

由圖 5可以看出,當(dāng)初始加入的 Cu2+和納米銅的濃度低于 0.15mg/L時(shí),96h藻液中的游離銅離子濃度較低,這可能是因?yàn)橐徊糠帚~離子與海水中的腐殖酸［11］、PO43-、OH-形成絡(luò)合物［2］,從而降低了藻液中銅離子濃度.當(dāng)兩者初始加入的濃度大于 0.15mg/L時(shí),藻液中游離銅離子的量逐漸增加,進(jìn)而對(duì)藻產(chǎn)生較大危害,使藻密度和葉綠素急劇下降.當(dāng) 96h微米銅的初始濃度低于 2mg/L時(shí),藻液中的銅離子濃度呈降低趨勢(shì),這可能是銅離子與腐殖酸和 PO43-形成聚合物.當(dāng)微米銅的初始濃度高于 2mg/L時(shí),藻液中的銅離子濃度呈明顯增加趨勢(shì).初始濃度相同的納米銅和微米銅在藻液中溶出的銅離子濃度不同.

圖3　不同形態(tài)和濃度銅試劑對(duì)中肋骨條藻的相對(duì)抑制率Fig.4　The relative inhibition rates of S. costatum under different form and concentration of copper reagents

圖4　不同形態(tài)銅試劑對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)（96h）Fig.4　The inhibition effects of different copper form and concentration on the growth of S. costatum （96h）

2.5藻細(xì)胞內(nèi)總銅離子與測(cè)定銅離子的比較

根據(jù)已有的方法［12］對(duì) ［M］/（［M］t-［M］）與［M］作圖,計(jì)算濾液中游離的銅離子.表 1為濾液中Cu2+的計(jì)算值與測(cè)定值的比較,結(jié)果表明測(cè)定值與理論計(jì)算值相差不大,只有當(dāng)初始濃度為0.05mg/L時(shí),會(huì)有較大差距,這可能是因?yàn)榇藭r(shí)濃度太低,以至于低于儀器的檢出限.

圖5　不同形態(tài)和濃度銅試劑實(shí)驗(yàn)組96h后游離銅離子的濃度變化Fig.4　Variations of the concentration of free copper ions in different copper reagents after 96h

根據(jù)濾液中的游離銅離子濃度可以得出海水中的銅絡(luò)合容量為 0.189mg/L,這與之前研究的海洋中銅的絡(luò)合容量為1.6×10-7～6.7×10-7mol/L很接近［13］.由濾液中的絡(luò)合量與Cu2+實(shí)驗(yàn)組中的總濃度與游離離子濃度差可以得出進(jìn)入藻細(xì)胞中的銅濃度.用銅離子實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)抑制率對(duì)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的銅離子作圖（圖6）,用它作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算其余2個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的銅離子,由此得出被細(xì)胞吸收的總銅量.由表2可知,當(dāng)初始加入的Cu2+濃度低于0.1mg/L時(shí),Cu2+不會(huì)進(jìn)入藻細(xì)胞,當(dāng)濃度大于0.1mg/L時(shí),Cu2+會(huì)進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi),對(duì)中肋骨條藻產(chǎn)生毒性.由表3可知,當(dāng)納米銅的濃度大于0.15mg/L 時(shí),銅離子會(huì)進(jìn)入藻細(xì)胞,而即使微米銅的濃度達(dá)到3mg/L,溶出的銅離子也不會(huì)進(jìn)入藻細(xì)胞.沒(méi)有進(jìn)入到藻細(xì)胞的銅離子可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)造成影響,還有可能會(huì)影響藻的光合作用,從而抑制藻的生長(zhǎng).總體來(lái)說(shuō),納米銅實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞內(nèi)的銅離子濃度大于微米銅實(shí)驗(yàn)組,與Cu2+實(shí)驗(yàn)組相當(dāng).納米銅對(duì)細(xì)胞的毒害作用大于微米銅,并且與Cu2+相差不大,這說(shuō)明納米銅對(duì)藻的毒性作用主要是溶出的銅離子,其次還有可能與納米粒子本身特殊的物理性質(zhì)有關(guān).

圖6　銅離子實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)抑制率與單個(gè)細(xì)胞中的銅離子含量關(guān)系Fig.4　The relationship between relative inhibition rate and the content of copper ion in single cell

表1　濾液中Cu2+含量的理論計(jì)算值與測(cè)定值的比較Table 1　Comparison of the theoretical calculated value and the measured value of Cu2+content in filtrate

表2　Cu2+實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞內(nèi)總銅離子與理論計(jì)算銅離子濃度的比較Table 1　Concentration comparison of the total value of Cu2+inside of algal cell and the theoretical value of Cu2+in the experimental groups of Cu2+

表3　納米銅與微米銅實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞內(nèi)總銅離子與測(cè)定銅離子的比較Table 1　Concentration comparison of the total value of Cu2+inside of algal cell and the measured value of Cu2+in the experimental groups of nano-copper and micro-copper

2.6討論

由 Cu2+,納米銅和微米銅對(duì)中肋骨條藻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,Cu2+和納米銅在較低濃度就會(huì)對(duì)藻產(chǎn)生毒性,而微米銅只有在濃度較大時(shí)才會(huì)有毒性,在濃度較低時(shí)還會(huì)促進(jìn)藻的生長(zhǎng).在96h時(shí)當(dāng)微米銅大于2mg/L時(shí),藻細(xì)胞會(huì)變小,而納米銅和微米銅在24h就會(huì)出現(xiàn)藻細(xì)胞變小的情況.由圖1和圖2可以看出,納米銅與Cu2+對(duì)藻的毒性大體趨勢(shì)一致,這說(shuō)明納米銅對(duì)藻的毒害作用主要是溶出的 Cu2+.苑志華等［14］的研究表明,納米銀會(huì)在溶液中溶出 Ag+,進(jìn)而會(huì)引起小球藻細(xì)胞內(nèi)的器官損傷,抑制小球藻的生長(zhǎng).相同濃度的納米銅和微米銅,納米銅對(duì)藻的毒害作用大,這說(shuō)明了粒子的大小會(huì)對(duì)藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響.李建宏等［15］認(rèn)為當(dāng)銅離子濃度達(dá)到0.64mg/L時(shí),幾乎能完全抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng),Cu2+對(duì)光合作用過(guò)程的抑制是阻止藻細(xì)胞生長(zhǎng)的重要原因.閆海等［9］表明銅離子對(duì)月形藻的96h EC50為199.5μg/L,毒性作用顯著,這種毒性作用主要是金屬離子與藻類(lèi)具有親和性,親和性越大越易抑制其生長(zhǎng).本研究中得出銅離子對(duì)中肋骨條藻96h EC50為0.07mg/L,這種毒性作用極其顯著.而且,有研究得出橢圓小球藻對(duì)納米銅粉的耐受力相對(duì)斜生柵藻、四列藻而言最弱,1.3mg/L的納米銅粉就可以完全抑制橢圓小球藻的生長(zhǎng),造成這一現(xiàn)象的原因很有可能與藻的種類(lèi)有關(guān)［16］.有研究表明納米銅對(duì)微藻的毒性很可能是由于其顆粒小,比表面積大,容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部使細(xì)胞壞死［17］,顆粒越小,納米粒子的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)就越明顯,本研究中的納米粒子的平均粒徑為 20nm,具有很強(qiáng)的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng),所以其對(duì)中肋骨條藻的毒性比較顯著.綜合起來(lái)主要原因還是納米銅粉特殊的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng).

納米銅對(duì)生物的毒性大于納米鋁和納米鈦,和納米鋅相差不大［18］.有研究表明納米粒子對(duì)藻的毒性作用很可能是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)局部氧化還原失衡,產(chǎn)生大量的細(xì)胞毒性從而抑制了藻的生長(zhǎng)［19］.超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的可以清除活性氧的抗氧化酶之一,它能夠保護(hù)生物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能.Sabatini［20］認(rèn)為柵藻體內(nèi)的 SOD會(huì)隨著外加Cu2+濃度增加而增加.尹海川［21］利用改性納米TiO2對(duì)藍(lán)藻的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),納米TiO2會(huì)導(dǎo)致藍(lán)藻的超氧自由基增多,致使葉綠素、光合作用都降低.雷靜靜等［22］發(fā)現(xiàn),nNiO會(huì)使四尾柵藻、普通小球藻和羊角月牙藻的抗氧化能力降低,最終抑制這3種藻的生長(zhǎng).

目前,納米材料可通過(guò)多種途徑進(jìn)入到海洋中,對(duì)水生生物造成極大的危害.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納米銅粉對(duì)中肋骨條藻的毒性主要是溶出的銅離子,其次,粒子的大小對(duì)藻的生長(zhǎng)也起到一定的作用.之前的研究主要集中在納米粒子溶出的金屬離子,而本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步推測(cè)納米本身也有作用,并且驗(yàn)證了這一推測(cè).傅鳳認(rèn)為 1.3mg/L的納米銅粉就可以使橢圓小球藻大量死亡［16］,并且當(dāng)其濃度大于0.3mg/L就會(huì)對(duì)3種綠藻產(chǎn)生抑制,本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是濃度大于0.15mg/L的納米銅粉就能很大程度的抑制中肋骨條藻的生長(zhǎng),這可能是因?yàn)椴煌脑鍖?duì)外界刺激的耐受性不同.

3　結(jié)論

3.1Cu2+,納米銅和微米銅在一定的濃度范圍內(nèi)會(huì)降低中肋骨條藻的藻密度和葉綠素含量,從而對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,總體呈劑量效應(yīng).

3.23種銅試劑對(duì)中肋骨條藻 96h的 EC50為：Cu2+＜納米銅＜微米銅,所以在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)3種銅試劑的毒性大小為Cu2+＞納米銅＞微米銅.

3.3初始濃度相同的納米銅和微米銅96h時(shí)溶出的離子濃度不同,并且納米銅的溶出度大于微米銅.

3.4納米銅實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞內(nèi)的銅離子濃度大于微米銅實(shí)驗(yàn)組,與Cu2+實(shí)驗(yàn)組相當(dāng).

3.5納米銅對(duì)細(xì)胞的毒害作用大于微米銅,并且與Cu2+相差不大,這說(shuō)明納米銅對(duì)藻的毒性作用主要是溶出的銅離子,其次還有可能與納米粒子本身特殊的物理性質(zhì)有關(guān).

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致謝：本實(shí)驗(yàn)的藻種來(lái)源于中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,在此表示感謝.

Inhibition effects of copper nanoparticles on the growth of Skeletonema costatum.

LI Fang-fang, PAN Rong, ZHANG Cai, WANG Jiang-tao*（College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2874～2880

By using Skeletonema costatum as experimental algae, the toxic effect of Cu2+, nanometer-copper, and micrometer-copper on it was studied. The results showed that the three copper reagents could inhibited the growth of S. costatum in different degrees. Generally, the increase value of chlorophyll and algal cell density had negative relationship with addition of the copper reagents. In the whole experimental period （96hours）, the growth of S. costatum was strongly inhibited if the concentration of Cu2+was higher than 0.1mg/L, and the algal density and chlorophyll were seriously affected as the concentration of nano-copper was higher than 0.15mg/L. Micro-copper stimulated the growth of S. costatum within 24h when its concentration was lower than 2mg/L. Algae growth was inhibited within 96h in high concentration of micro-copper （＞1mg/L）. The mechanism of the toxic effect of copper nanoparticles on Skeletonema costatum was attributed to its dissolved copper ions and the nanoparticles itself.

nanometer-copper；micrometer-copper；Cu2+；Skeletonema costatum

X503.225

A

1000-6923（2015）09-2874-07

2015-02-10

全球變化與海氣相互作用專(zhuān)項(xiàng)（GASI-03-01-02-01）

*責(zé)任作者, 教授, jtwang@ouc.edu.cn

李芳芳（1989-）,女,山東德州人,中國(guó)海洋大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境分析.