寒地大豆胞囊線蟲生防菌的篩選及防治效果研究

遲君道，王笑庸，樊川，楊旭升（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱15000；.黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱150086；.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱150001；.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150086）

寒地大豆胞囊線蟲生防菌的篩選及防治效果研究

遲君道1，2，王笑庸4，樊川2，楊旭升3
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030；2.黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱150086；
3.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱150001；4.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150086）

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)連作16年的大豆試驗(yàn)田中，分離篩選獲得15株菌株作為研究對(duì)象，確定不同菌株對(duì)線蟲胞囊的浸染效果，以及不同菌株發(fā)酵液及浸出液在不同處理時(shí)間內(nèi)對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲的抑制作用，評(píng)價(jià)不同菌株對(duì)大豆胞囊線蟲的防治效果，最后確定生防效果較好的菌株。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，有4個(gè)菌株對(duì)胞囊線蟲的抑制作用有明顯差異，其中1株對(duì)胞囊線蟲的致死作用強(qiáng)烈。

生防因子；生物防治；胞囊線蟲

黑龍江省大豆重迎茬現(xiàn)象普遍存在，導(dǎo)致大豆胞囊線蟲發(fā)病率逐年提高，由于大豆胞囊線蟲胞囊具有防護(hù)外殼，專性寄生于大豆根部，防治難度極大。生產(chǎn)中通過種植抗線蟲品種、合理的耕作方式、灌溉、土壤沙化改良等方法，都能取得一定的防治效果，但這些方法都存在很大局限性。因受各種實(shí)際條件限制，黑龍江產(chǎn)區(qū)難以實(shí)行合理輪作，抗線育種雖然是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)有效且比較環(huán)保的措施，但存在豐產(chǎn)性、地域性等問題，也很難實(shí)現(xiàn)普及推廣，所以抗線蟲生防菌株的分離篩選被廣泛應(yīng)用研究［1-2］。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)生防菌在連作16年的大豆試驗(yàn)田提取提純，胞囊線蟲在同一地塊分離篩選。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2013年8月——2014年7月于生物肥料研究中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)分別將2×109/m L生防菌液1m L，均勻轉(zhuǎn)至PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d，將消毒后的胞囊10枚放入PSA培養(yǎng)基菌落附近。培養(yǎng)7d后，觀察線蟲生防菌對(duì)胞囊的浸染狀況，并記錄結(jié)果；分別用濃度為2×109/m L生防菌發(fā)酵液和浸出液測(cè)定對(duì)二齡幼蟲的抑制作用，統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1鏈霉菌的分離篩選

用平板稀釋法進(jìn)行生防菌株篩選，利用培養(yǎng)基平板進(jìn)行拮抗性測(cè)定。用濾紙片法，觀察在抗生菌周圍是否會(huì)出現(xiàn)明顯的抑菌圈。選擇抑菌圈的大和透明度高的菌株作為試驗(yàn)菌株，被選定的4個(gè)菌株分別命名為HKS1405、HKS1406、HKS1407、HKS1408。

1.3.2土壤樣品中的胞囊進(jìn)行分離

將試驗(yàn)田中取回的土樣加適量的水?dāng)嚢?，使土樣完全溶解，靜置2～3m in后，把懸浮液倒入嵌在60目網(wǎng)篩中的40目網(wǎng)篩內(nèi)，重復(fù)操作3次。去除上層網(wǎng)篩上的殘余物，細(xì)水流把60目網(wǎng)篩上的沉積物中的泥沙緩慢沖去，剩余部分收集在干凈的燒杯中。燒杯中的懸浮液經(jīng)過多次緩慢淘洗，去除下層沉淀的泥沙，把上層樣品倒入墊有雙層擦鏡紙的漏斗內(nèi)過濾，把雙層擦鏡紙和過濾后的剩余物移入洗凈的培養(yǎng)皿中，從中在解剖鏡下用鑷子挑取棕色新鮮飽滿的胞囊，放入4℃冰箱備用。

胞囊線蟲生防菌的分離與純化。在培養(yǎng)皿底部墊上一張滅過菌的圓形定性濾紙，將包囊放置在濾紙上，蓋蓋標(biāo)記好后，25℃下保濕培養(yǎng)7d。7d后，將表面長(zhǎng)菌的胞囊挑出，在（PSA）固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出以后，切取菌落邊緣的菌絲體轉(zhuǎn)至PSA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3d。3d后，將培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌體轉(zhuǎn)入PSA斜面上進(jìn)行保存

1.3.3二齡幼蟲的制備

將試驗(yàn)中分離出的胞囊，加水研磨破壁，倒出混合液，過篩，收集60目下、270目上的物質(zhì)，置于20m L離心管中。加入35%蔗糖溶液，2 500r/m in離心5m in。將離心后的液體用0.1%NaClO溶液中消毒3m in，然后用無菌水沖洗，完成二齡幼蟲培養(yǎng)液的制備。

1.3.4線蟲生防菌對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊的寄生性

將分離出的生防菌株轉(zhuǎn)至PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到菌落直徑長(zhǎng)至培養(yǎng)皿1/2時(shí)，將消毒后的胞囊放入菌落邊緣，每皿10個(gè)胞囊。培養(yǎng)7d后，將胞囊移除出培養(yǎng)皿，0.5%NaC lO表面消毒5m in，每個(gè)胞囊分別放于一個(gè)經(jīng)過滅菌的濾紙片上，保濕培養(yǎng)7d。7d后觀察長(zhǎng)菌情況，了解菌株對(duì)胞囊的寄生性。

1.3.5發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲的影響

將斜面培養(yǎng)的純化菌落挑取在100m L無菌水中，調(diào)整菌懸液濃度為2×109/m L，分放于4個(gè)三角瓶中，用等量無菌水做對(duì)照，每瓶放置10條線蟲，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，12h、24h、36h、48h、60h、72h后觀察線蟲死亡情況，記錄線蟲僵直死亡率。

1.3.6浸出液對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲活性的影響

將分離并純化的菌株接種到PAS培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面，分別向試管中加入10m L無菌水浸泡，于20℃培養(yǎng)箱內(nèi)，7d后收集過濾液。取滅菌的貝氏小皿，每皿滴加過濾液10m L，分別加入10條二齡幼蟲，3次重復(fù)，無菌水對(duì)照。在25℃下，分別于12h、24h、36h、48h、60h、72h鏡檢觀察，確定線蟲的僵直死亡率。

2　結(jié)果與分析

2.1不同線蟲生防菌對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊的寄生性

表1　生防菌對(duì)胞囊的寄生率Tab.1 The parasitism rate of bio-controlbacteria to soybean cyst

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)說明，4個(gè)生防菌對(duì)胞囊線蟲胞囊都有較強(qiáng)的寄生性，跟對(duì)照對(duì)比差異顯著，其中HKS1408對(duì)胞囊的寄生率達(dá)到90%。

2.2發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲的影響

表2　發(fā)酵菌液對(duì)胞囊線蟲二齡幼蟲的致死率Tab.2 The fata lity ra te of ferm entation bro th to soybean cyst nematode's second instar larvae

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，4個(gè)生防菌的發(fā)酵液對(duì)二齡幼蟲都有極強(qiáng)的抑制作用，在接觸發(fā)酵液后，二齡幼蟲游動(dòng)頻率逐漸減慢，數(shù)小時(shí)內(nèi)部分蟲體逐漸僵直，72h后大部分蟲體僵直不動(dòng)，少數(shù)未死亡蟲體也接近僵直，游動(dòng)緩慢。其中HKS1408在72h抑制率達(dá)到100%。

2.3浸出液對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲活性的影響

表3　浸出液對(duì)胞囊線蟲二齡幼蟲的致死率Tab.3 The fatality rate of lixivium to soybean cyst nematode's second instar larvae

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，4個(gè)生防菌的浸出液對(duì)二齡幼蟲都有較強(qiáng)的抑制作用，接觸12h內(nèi)開始僵直死亡，對(duì)應(yīng)不同時(shí)間段死亡率較發(fā)酵液略低，平均致死率也超過70%，其中HKS1408在72h抑制率達(dá)到90%。

3　結(jié)語

通過肉眼觀察生防菌對(duì)胞囊線蟲胞囊的浸染率以及通過鏡檢觀察二齡幼蟲對(duì)生防菌發(fā)酵液和浸出液的

反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)從大豆連作田中分離的4個(gè)生防菌株對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊都有較強(qiáng)的浸染作用，發(fā)酵液和浸出液對(duì)二齡幼蟲的抑制作用也非常明顯，其中HKS1408的抑制率幾乎達(dá)到100%，由于以上4個(gè)菌株為寒地大豆重茬田中提取，因此可以確定該菌株很容易在寒地大豆土壤中定植，而且會(huì)在一定程度上起到抑制大豆胞囊線蟲的作用［3-4］。

對(duì)以上4個(gè)菌株的浸出液中有效成分的分析鑒定有利于進(jìn)一步確定其生防機(jī)制，也將為大豆生物防治產(chǎn)品的生產(chǎn)研究提供依據(jù)。

［1］陳井生，陳立杰，段玉璽，等.放線菌Snea49的分類鑒定及對(duì)胞囊線蟲的活性評(píng)價(jià)［J］.大豆科學(xué)，2010，29（4）：663-635.

［2］國家大豆工程技術(shù)研究中心·發(fā)展戰(zhàn)略部.關(guān)于黑龍江省大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展建議［J］.大豆科技，2010，（06）：33-35.

［3］劉冰.大豆胞囊線蟲病的發(fā)生條件及防治措施［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011，（03）：186.

［4］杜春梅，李海燕，李曉明，等.HND1生物種衣劑防治大豆胞囊線蟲藥效研究［J］.大豆科學(xué)，2009，28（6）：1126-1129.

Research on Screening and Bio-contro l Effect o f Soybean Cyst Nem atode's Germ Strains in Co ld Regions

CHIJundao1.2，WANG Xiaoyong4，F(xiàn)AN Chuan2，YANGXusheng3
（1.Northeastern AgriculturalUniversity，Harbin 150030，China；2.Bio-fertilizer Research Center，HAS，Harbin 150086，China；3.Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150001，China；4.Institute ofMicrobiology，HAS，Harbin 150086，China.）

The research isolated 15 strains as the objects from the soybean experimental fields of Northeast Agricultural University，which lasted for 16 years'cropping soybean.The sutdy is to determine different strains' infection effect to nematode cyst and inhibition of fermentation br oth and lixivium of differentstrains to juvenile in different processing time.The ultimate object is to analyze and assess the bio-control effect of different strains to Soybean CystNematodeand finally tomake sure the strainswith betterbio-controleffects.The resultsshowed that byway of contrast therewere obvious differences in inhibition of four strains to CystNematode.It found out thatone of four strainshad very strong lethaleffectto CystNematode.

Bio-control factor；Biological control；Cystnematode

S435.651

A

1674-8646（2015）05-0020-03