SUMO-2/3活化介導丹參對缺血神經元的保護機制*

王慧鋼，于思淼，邱　瑾，劉振林

（1天津市濱海新區大港小王莊鎮社區衛生服務中心，天津300273；2天津中醫藥大學，天津300193；3天津安捷臨奧腦科醫院神經外科，天津300402）

·實驗研究·

SUMO-2/3活化介導丹參對缺血神經元的保護機制*

王慧鋼1，于思淼2，邱瑾3，劉振林3

（1天津市濱海新區大港小王莊鎮社區衛生服務中心，天津300273；2天津中醫藥大學，天津300193；3天津安捷臨奧腦科醫院神經外科，天津300402）

［目的］從類泛素化（SUMO）角度研究丹參對缺血性腦血管病后的神經元保護機制。［方法］原代分離培養SD大鼠海馬神經元細胞，免疫熒光方法予以鑒定；制作神經元體外氧糖剝奪（OGD）模型，分為對照組、OGD組和丹參治療組；酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測乳酸脫氫酶（LDH）含量，原位凋亡法檢測凋亡細胞率；蛋白印記和免疫熒光方法檢測SUMO-1和SUMO-2/3在細胞內的表達定量和定位情況。［結果］所培養細胞高表達神經元特異性烯醇化酶（NSE）和微管相關蛋白-2（MAP-2），膠質纖維酸性蛋白（GFAP），神經元純度大于95%；ELISA結果顯示，3組中LDH含量對照組＜丹參治療組＜OGD組；凋亡細胞率對照組＜丹參治療組＜OGD組；蛋白印記結果顯示，神經元接受OGD處理后SUMO-2/3的蛋白表達量明顯上升（P＜0.05），但SUMO-1無明顯變化（P＞0.05），而丹參治療能夠進一步提高SUMO-2/3的表達（P＜0.05）；免疫熒光結果顯示OGD神經元發生了SUMO-2/3由細胞漿向細胞核的明顯移位現象，而丹參治療能夠進一步增強這種效果。［結論］丹參能夠通過誘導SUMO-2/3，而非SUMO-1的活化機制，發揮對缺血神經元的保護作用。

缺血性腦血管病；小類泛素蛋白；丹參；神經元

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.10

腦卒中是嚴重危害人類生命健康的神經系統疾病之一［1］。丹參能夠通過擴張心腦血管，減少氧自由基生成，保護內皮細胞等機制改善腦卒中后的氧化應激反應，增加神經保護作用［2］。新近研究發現，一種類泛素蛋白（SUMO）在腦缺血發生后可被顯著激活，并對神經元具有肯定的保護作用［3］。但到目前為止，尚未見到有關于中藥丹參對卒中后SUMO通路調控的報道。本研究旨在通過觀察丹參對體外培養的氧糖剝奪（OGD）神經元中3個最主要的SUMO家族成員SUMO-1～3的表達調控，推測SUMO通路是否介導了丹參對缺血神經元的保護作用機制，為未來基于SUMO這類小分子蛋白物質的中成藥物開發提供有價值的參考和借鑒。

1　資料與方法

1.1試劑與動物10mL裝丹參注射液（杭州正大青春寶藥業公司）；改良Eagle培養基（DMEM，美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青）；乳酸脫氫酶（LDH）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（武漢博士德）；原位凋亡檢測試劑盒（北京百浩）；兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶（NSE）、微管相關蛋白（MAP-2）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）均購自北京中杉公司，兔抗大鼠SUMO-1和SUMO-2/3（北京中原領先）；孕齡18 d SD大鼠4只購自中國軍事醫學科學院，飼養于中國協和醫科大學血液病研究所實驗動物中心，無菌，溫度20～25℃，濕度（50±5）%。

1.2神經元原代培養將SD大鼠脫頸處死，75%乙醇消毒5min，在超凈臺上取出全腦，小心剝離并去除腦膜及脈絡叢，分離雙側海馬，剪成約1mm3的小塊，在孵箱中以0.25%胰蛋白酶消化5min。以1.0×106密度接種細胞到經多聚賴氨酸鋪板過夜處理的培養皿中，37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度條件下培養。6～8 h細胞貼壁后，換培養基為含2% B27的Neurobasal，含有B27和0.5mmol/L的谷氨酰胺。培養2～3 d培養基中加入8～10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神經細胞和原代膠質增殖。每3天用Neuronbasal使用液半量換液。

1.3免疫熒光方法鑒定將培養第8天的細胞用4%多聚甲醛室溫固定30min，1%Triton X-100室溫處理10min，10%羊血清封閉30min，甩去血清，滴加不同稀釋度的MAP-2（1∶500）、GFAP（1∶500）、NSE（1∶500）抗體，置濕盒中4℃過夜，空白對照以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗；轉日滴加適當比例稀釋的異硫氰酸熒光素（FITC）或四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記二抗，置濕盒中37℃孵育45min；封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4神經元OGD模型的建立取培養第8天后的神經元進行后續實驗。共分為以下3組：1）對照組：單純海馬神經元，不進行其他干預處理。2）OGD組：細胞置于OGD液中處理4 h，然后吸去OGD液，PBS洗滌，加入標準DMEM高糖培養液繼續培養20 h。3）以含200mg/L丹參注射液的OGD液取代單純OGD液，其他步驟同2）。

1.5 LDH活力檢測上述分組細胞在培養箱中繼續培養24 h后按照ELISA說明書對條件培養液進行LDH含量檢測。

1.6細胞原位凋亡檢測將繼續培養24 h后的細胞于4%中性甲醛固定10min，3%過氧化氫甲醇中浸洗10min，用蛋白酶K孵育15min，PBS洗滌后加入50μL的TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃孵育60min，4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）復染，封片及鏡下觀察。計算細胞凋亡率（細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%）。

1.7 Western blot方法提取細胞總蛋白，電泳及轉膜后脫脂奶粉封閉1 h，滴加相應一抗，抗體稀釋度為SUMO-1（1∶2 000）、SUMO-2/3（1∶2 000）和βactin（1∶500），4℃水平搖床孵育過夜，次日使用辣根酶標記的1∶500稀釋二抗孵育2 h。凝膠成像系統掃描光密度值，Quantity One軟件進行定量分析。

1.8細胞免疫熒光方法方法同1.3，抗體稀釋度為SUMO-1（1∶1 000）和SUMO-2/3（1∶1 000）。

1.9統計學方法應用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，組間兩兩比較采用Dunnett’sT3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1神經元鑒定結果見圖1，TRITC熒光標記顯示為紅色細胞漿著色，FITC熒光標記顯示為綠色細胞漿著色。可見所培養的細胞高表達神經元特異標記蛋白NSE，其陽性表達率為（96.47±3.45）%和MAP-2，其陽性表達率為（96.22±3.21）%，幾乎不表達膠質細胞標記蛋白GFAP，其陽性表達率為（0.79±0.27）%，同時綜合上述鑒定結果，可見所培養的神經元細胞純度較高，即大于95%，符合后續實驗要求。

2.2 LDH濃度和細胞凋亡率測定結果由ELISA實驗結果可以看出，對照組中未經任何處理的神經元LDH水平非常低，在OGD組神經元LDH的水平明顯增高（P＜0.01），丹參治療組LDH水平則明顯低于OGD組（P＜0.05）；細胞凋亡實驗結果顯示了相似的趨勢，見表1、圖2。

圖1　神經細胞標志蛋白熒光檢測Fig.1 The expression of neural cell m arker proteins detected by fluorescenceassay

表1　不同組別乳酸脫氫酶濃度及細胞凋亡率比較（x±s）Tab.1 Com parison of lactate dehyd rogenase concentration and the rateof cellapoptosisamong differentgroups（x±s）

圖2　 TUNEL方法檢測細胞凋亡情況Fig.2 Cellapoptosisdetected by TUNEL assay

2.3 Western blot結果由結果可以看出游離及共價結合狀態的SUMO-1蛋白表達水平在3組間沒有明顯變化（F=0.978，P＞0.05），游離狀態的SUMO-2/3在3組間比較沒有統計學差異（F=1.237，P＞0.05）但共價結合狀態的SUMO-2/3在3組間比較有統計學差異（F=11.417，P＜0.05），見圖3。

2.4免疫熒光結果SUMO-1蛋白在3組中均定位于細胞漿，3組間無明顯變化；SUMO-2/3在對照組主要表達于細胞漿，接受OGD處理后SUMO-2/3發生了明顯向細胞核的轉移，在丹參治療組這種趨勢進一步加劇，見圖4。

圖3　 W estern blot檢測SUMO蛋白表達水平Fig.3 Expression of SUMO detected by W estern blotassay

圖4　 SUMO成員在不同組中的表達定位熒光檢測Fig.4 Expression and localization of SUMO members in the differentgroups detected by fluorescenceassay

3　討論

腦卒中是一種突發的腦血液循環障礙性疾病，是指因各種誘發因素引起腦內動脈狹窄，閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環障礙，臨床上表現為一過性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征［4-6］。主要包括腦梗死、腦出血等疾病，其原因可由動脈粥樣硬化加重致血管過度狹窄、栓子脫落、動脈瘤破裂或顱內腫瘤內灶性出血等引起［7-9］。當前臨床治療主要以外科手術及血管內介入治療為主，但這些治療均需要在發病短時間內接受治療，且治療后期的神經功能恢復大多并不理想，而對于偏遠地區的腦卒中患者受醫療條件的限制，使死亡和致癱風險倍增［10-13］。因此有必要進一步認識腦卒中的病情演進機制，并尋找新的有效的救治性藥物。

SUMO是一類結構與泛素蛋白相似，但功能迥異的蛋白質翻譯后修飾小分子蛋白［14-15］。與泛素蛋白降解靶蛋白機制不同，SUMO常常與泛素競爭靶蛋白結合位點，抑制蛋白遭到由泛素介導的蛋白酶的降解，故而多對靶蛋白起到一定的保護作用［16-18］。有研究表明，腦組織急性缺血缺氧發生后，會誘發SUMO循環通路的快速激活和反應，特別是使原本存在于細胞漿中游離狀態的SUMO-2/3快速與大量靶蛋白結合，使部分蛋白質免于泛素介導的蛋白酶降解，同時啟動細胞核做出積極的反應，誘導產生新的神經保護性蛋白，發揮神經損傷修復作用［19］。

基于上述理論，筆者首次對傳統血管保護性中藥丹參進行實驗研究，旨在從類泛素化角度研究丹參對缺血性腦血管病后的神經元保護機制。首先使用原代分離培養法獲得了高純度的SD大鼠海馬神經元細胞，以其為研究對象，制作了神經元OGD模型，并給予丹參治療。LDH屬糖酵解酶，LDH測定常用于診斷心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤，其含量的顯著增高常反應病情的嚴重程度［20］。在體外實驗中，常被用來檢測所培養細胞的受損害程度。本研究的結果顯示，在所檢測的3組中LDH含量對照組＜丹參治療組＜OGD組，提示丹參治療組的神經元受損程度明顯低于OGD組，這種趨勢在原位凋亡實驗中得到相同的驗證。這均反應丹參作為一種血管保護性藥物對于因缺血所致的神經元損傷具有肯定的神經保護作用。

為進一步研究其內在機制，筆者利用蛋白印記方法對SUMO1-3的蛋白表達水平和蛋白定位進行研究。本研究結果顯示，神經元接受OGD處理后SUMO-2/3的蛋白表達量明顯上升，但SUMO-1無明顯變化，而丹參治療能夠進一步提高SUMO-2/3的表達；免疫熒光結果顯示OGD神經元發生了SUMO-2/3由細胞漿向細胞核的明顯移位現象，而丹參治療能夠進一步增強這種效果。由此得出結論，丹參能夠通過活化SUMO-2/3，而非SUMO-1的機制，發揮對缺血神經元的保護作用。

總之，通過本實驗筆者首次報道傳統中藥丹參可以通過激活SUMO循環通路途徑，誘導多個靶蛋白的SUMO化作用，對受損神經元發揮神經保護作用。這一結論豐富了丹參對于腦卒中的神經保護機制理論，為新型小分子藥物的研發提供了新的參考。參考文獻：

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Theactivation of SUMO-2/3mediated protection effectsof Salviam iltiorrhiza on ischem ic neurons

WANGHui-gang，YU Si-m iao，QIU Jin，LIU Zhen-lin
（1.Xiaowangzhuang Community Health Service Center，Dagang District，BinhaiNew Areaof Tianjin，Integrated TraditionalChineseand Western Medicine，Tianjin 300273，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Neurosurgenry Department，Tianjin Anjie LinaoBrain Hospital，Tianjin 300402，China）

［Objective］To study the protectionmechanism of salviamiltiorrhiza on neuronsafter ischem ic cerebral vascular disease from the field ofsmallubiquitin-like protein（SUMOs）.［M ethods］The neuronswere cultured from the hippocampalof SD rats，and identified by fluorescence immunoassaymethod.Aftermaking oxygenglucose deprivation（OGD）model for neurons，we designed threegroups for thisstudy:controlgroup，OGDgroup and salviamiltiorrhizagroup.The lactate dehydrogenase（LDH）contentwasdetected by ELISA，and apoptosisby apoptosis in situ.Then the quantitative expression and intracellular localization of SUMO-1and SUMO-2/3 proteinswere detected bywestern blotand immunofluorescencemethod.［Results］The cultured cellswerewith high expression ofneuron specific enolase（NSE）and microtubule associated protein-2（MAP-2），but low levelofglial fibrillary acidic protein（GFAP），the neuron puritygreater than 95%.ELISA results showed that the contentof LDH in the threegroupswere controlgroup＜Salviamiltiorrhizagroup＜OGDgroup，as well as the results from apoptosis.Western blotting results showed that the level of SUMO-2/3 of neurons received OGD treatmentwas raised significantly（P＜0.05），buttherewasno significantchange in SUMO-1（P＞0.05），and salviamiltiorrhiza treatmentcan further improve the expression ofSUMO-2/3（P＜0.05）.Immunohistochemistry resultsshowed that therewasapparentshiftof SUMO-2/3 from cytoplasm to nucleus in OGD neurons，and salviamiltiorrhiza treatment could further enhance this effect.［Conclusion］Salviamiltiorrhiza can induce SUMO-2/3 activation and enhance protecteffectson ischemic neurons.

ischemic cerebrovascular disease；smallubiquitin like protein；Salviamiltiorrhiza；neuron

R743

A

1672-1519（2015）07-0420-04

國家自然科學基金項目（81471175）。

王慧鋼（1973-），男，主治醫師，主要從事內科系統疾病的中西醫結合治療。

劉振林，E-mail：wjzhenlin817@163.com

（2015-01-28）