“活血開竅湯”對MCAO模型大鼠血腦屏障通透性的時效性影響*

趙金生，孟凡征，殷　韻，李　平

“活血開竅湯”對MCAO模型大鼠血腦屏障通透性的時效性影響*

趙金生1，2，孟凡征1，殷韻2，李平3

（1.天津市南開醫院腦病科，天津300100；2.天津醫科大學，天津300070；3.天津市第三中心醫院，天津300170）

［目的］探討“活血開竅湯”不同給藥時間對大腦中動脈梗死（MCAO）模型大鼠神經功能恢復及血腦屏障的時效性影響。［方法］將48只MCAO模型Wistar大鼠隨機分為模型組及活血開竅湯治療組（Ⅰ組：造模后2 h給藥組；Ⅱ組：造模后24 h給藥組；Ⅲ組：造模后48 h給藥組），每組12只，另有12只大鼠作為假手術組。采用Zealonga評分法觀察各組大鼠神經功能缺損情況，取材前2 h于尾靜脈注射伊文思藍（EB）溶液以觀察各組大鼠血腦屏障（BBB）的通透性，免疫組化法觀察各組大鼠腦組織Claudin-5蛋白含量情況。［結果］各治療組大鼠神經功能較模型組均有改善，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。活血開竅湯Ⅱ、Ⅲ組大鼠腦缺血側紋狀體EB含量低于模型對照組（P＜0.05），Claudin-5蛋白含量相對較高（P＜0.05）。而活血開竅湯Ⅰ組與模型對照組相比，活血開竅湯Ⅱ組與Ⅲ組相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。［結論］活血開竅湯可通過減輕BBB通透性，減少Claudin-5蛋白的破壞從而保護MCAO大鼠血腦屏障，但在急性期對BBB的保護作用并不十分明顯，且尚不能證明在非急性期越早給予活血開竅湯對BBB的保護作用就越顯著。

活血開竅湯；大腦中動脈梗死；血腦屏障；Claudin-5蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.11.11

“活血開竅湯”是由導師李平教授總結出的治療腦梗死有效的方劑，經多年臨床實踐證明，此方具有活血開竅、通絡補腎的作用，在治療腦梗死方面具有肯定的療效。本課題組早期的實驗［1-2］已證實，活血開竅湯對大腦中動脈缺血再灌注損傷模型大鼠有一定的腦保護作用，可有效改善模型大鼠的神經功能。而本實驗在上述研究的基礎上通過觀察活血開竅湯不同給藥時間對大腦中動脈缺血模型（MCAO）大鼠血腦屏障（BBB）通透性以及腦組織Claudin-5蛋白含量的影響，來探討活血開竅湯對MCAO大鼠血腦屏障的保護作用機制，以期為臨床用藥提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質量200～230 g，由天津醫科大學動物中心提供。分籠飼養，飼養溫度22～25℃，給予普通飼料（天津醫科大學動物中心提供），自由飲水，相對濕度40%～60%。

1.2實驗試劑及儀器伊文思藍（EB）染料（北京化學試劑公司），Claudin-5上下游引物（上海生物工程），4%多聚甲醛、肝素液、注射用青霉素鈉、甲酰胺溶液（天津愛基生公司），造模所需手術器械（上海金鐘醫療器械廠），直徑0.26 mm魚線（日本PATU公司），恒溫冰凍切片機、SDC-6低溫恒溫槽（Leica公司），低溫離心機、超聲波粉碎機、移液槍（Eppendorf公司），BECKMAN超高速離心機（美國貝克曼儀器公司），Motic AE31熒光顯微鏡（Motic公司）。

1.3MCAO模型的制備及分組將大鼠飼養3 d后禁食24 h，采用Zea-Longa線栓法［3］制備大鼠左側MCAO模型：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，待大鼠麻醉后，將其腹面向上固定于手術臺上，頸部備皮，于頸部正中稍左0.5 cm作一切口，切開皮膚及皮下組織，依次暴露并分離大鼠左側頸總、頸內及頸外動脈，結扎頸總及頸外動脈，距頸總動脈分叉處約5 mm處用眼科剪小心剪開一斜行切口，將頭端圓鈍并經多聚賴氧酸處理的線栓由切口處插入頸內動脈，從血管分叉口開始計算，當插入深度約18 mm時，感到手下有輕微阻力后，放慢速度，以防刺破大腦中動脈。當線栓插入正常長度后（穿到大腦中動脈），結扎頸內動脈，固定線栓后縫合。

排除造模失敗及死亡大鼠后，剩余48只造模成功大鼠。按照隨機數字表法將模型大鼠隨機分為模型組（Model）、活血開竅湯Ⅰ組（造模后2 h給藥）、Ⅱ組（造模后24 h給藥）、Ⅲ組（造模后48 h給藥），每組大鼠均12只。另選取12只大鼠作為假手術組（Sham），Sham組大鼠僅分離頸總、頸內及頸外動脈，不予以結扎及插線。

1.4實驗用藥及干預方案活血開竅湯煎劑組成：天麻7.5 g，牛膝15 g，遠志10 g，葛根15 g，川芎10 g，丹參15 g，蘇合香0.5 g，郁金7.5 g，白僵蠶7.5 g，所煎湯劑濃縮至生藥成分2 g/mL，所用中藥均由天津市南開醫院中藥房提供，由南開醫院藥研室煎制濃縮而成。根據人鼠給藥劑量換算公式（d大鼠=d人× 0.71/0.11）［4］給予模型大鼠的活血開竅湯生藥量為0.21 g/（60 g·d）。活血開竅湯Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別在造模后2、24、48 h首次給藥，各治療組均連續灌藥7 d，假手術組及模型組分別在造模后24 h每天給予等量的生理鹽水連續灌胃7 d。

1.5觀察指標及操作

1.5.1大鼠神經功能缺損評分根據Zea-Longa神經功能損傷評價標準［3］（0分:無神經缺損癥狀。1分：不能伸展對側前爪。2分：行走時向偏癱側轉圈。3分：向偏癱側傾倒。4分：不能自發行走，意識喪失動）對各組大鼠神經功能缺損情況分別于術后2 h、24 h、72 h、處死前2 h進行評分。

1.5.2缺血側紋狀體伊文思藍（EB）測定各組大鼠干預7 d后于尾靜脈注射2%EB溶液（3 mL/kg），2 h后用生理鹽水行心臟灌注以清除血管內的EB，斷頭取腦，放入液氮中迅速冰凍后移入-80℃冰箱中保存，將冰凍的腦組織在低溫恒溫槽中切成16～20 μm厚的切片，放入熒光顯微鏡對缺血側紋狀體組織進行EB含量的測定。

1.5.3大腦皮質Claudin-5陽性細胞表達的測定免疫組化法檢測大腦皮質Claudin-5的表達：1）把切片置于37℃烘箱內烘2 h，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）液漂洗5 min×3次。2）0.3%去離子水浸泡10 min，以阻斷內源性過氧化酶，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。3）山羊血清37℃封閉1 h，甩干，勿洗。4）加入以1∶200比例稀釋的山羊抗大鼠Claudin-5多克隆抗體4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。5）加入二抗37℃孵育1 h，取出，用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。6）加入辣根素37℃孵育15 min，取出，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。7）二氨基聯苯胺（DAB）顯色：加入0.01%DAB顯色液顯色（3 min，顯微鏡下掌握染色程度），自來水沖洗。8）蘇木素浸泡30 s復染、自來水沖洗。9）1%稀鹽酸分化10s-1%氨水返藍10 s-乙醇梯度脫水85%-90%-95%-100%，各1 min。10）二甲苯透明3 min×2次，用中性樹膠封片（陰性對照片以PBS緩沖液代替一抗，其余操作同前）。

1.6統計學處理利用SPSS18.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠神經功能缺損比較大鼠約在造模后1～2 h內蘇醒，Sham組無神經功能缺損表現，模型組及各實驗組大鼠均出現神經功能缺損癥狀。各實驗組大鼠與模型組比較，神經功能缺損評分差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠不同時間點神經功能缺損評分（±s）Tab.1　Neural function defect scale at different time points of each group of rats（±s）分

表1　各組大鼠不同時間點神經功能缺損評分（±s）Tab.1　Neural function defect scale at different time points of each group of rats（±s）分

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別造模后2 h造模后24 h造模后48 h造模后7 d Sham組0000模型組5.66±0.72*5.57±0.58*5.47±0.54*5.34±0.68*活血開竅湯Ⅰ組5.54±0.45*4.76±0.38*#4.38±0.65*#2.35±0.78*#活血開竅湯Ⅱ組5.84±0.54*5.68±0.27*4.91±0.39*#3.74±0.64*#活血開竅湯Ⅲ組5.71±0.62*5.68±0.43*5.36±0.75*4.72±0.81*#

2.2各組大鼠缺血側紋狀體EB含量比較各組大鼠缺血側紋狀體EB信號較對側明顯增強，而Sham組大鼠腦組織中未觀測到明顯的EB滲漏。模型組、活血開竅湯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組雙側大腦EB含量差異均有統計學意義（P＜0.05）。而各實驗組大鼠缺血側紋狀體EB含量明顯低于模型組，且差異均有統計學（P＜0.05），并且，活血開竅湯Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腦組織中EB濃度較Ⅰ組降低的更為明顯，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3各組大鼠大腦皮質Claudin-5陽性細胞表達的比較Claudin-5在各組大鼠腦組織中呈陽性表達，且染色呈棕黃色，在Sham組大鼠腦血管內皮細胞上表達豐富。與假手術組相比，MCAO模型組和活血開竅湯組陽性細胞表達量減少，造模后2 h首次給藥組Claudin-5的表達水平顯著降低，呈間斷表達。活血開竅湯Ⅱ組和Ⅲ組Claudin-5表達水平較模型組增加，不僅表達于微血管內皮細胞，在微血管周圍的星形膠質細胞亦可見其陽性表達。與模型組比較，活血開竅湯Ⅱ組、Ⅲ組腦組織中Claudin-5表達水平增高，各時間點差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表3。

表2　各組大鼠兩側大腦紋狀體中EB含量比較（±s）Tab.2　Comparison of EB content in both sides of the brain striatum in each group of rats（±s）μg/g

表2　各組大鼠兩側大腦紋狀體中EB含量比較（±s）Tab.2　Comparison of EB content in both sides of the brain striatum in each group of rats（±s）μg/g

注：與模型組相比，*P＜0.05；與Sham組相比，#P＜0.05；與活血開竅湯I組相比，△P＜0.05。

組別缺血側非缺血側Sham組3.24±1.06*4.16±0.97模型組17.03±3.09#4.22±0.51活血開竅湯Ⅰ組15.01±2.37#4.24±1.06活血開竅湯Ⅱ組9.86±2.83*#△4.13±0.86活血開竅湯Ⅲ組7.91±2.46*#△4.07±1.03

表3　各組大鼠大腦皮質Claudin-5陽性細胞計數及免疫組化評分（±s）Tab.3　Claudin-5 positive cells expression in cerebral cortex and immunohistochemical score in each group of rats（±s）

表3　各組大鼠大腦皮質Claudin-5陽性細胞計數及免疫組化評分（±s）Tab.3　Claudin-5 positive cells expression in cerebral cortex and immunohistochemical score in each group of rats（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與Sham組相比，#P＜0.05。

組別陽性細胞比（%）整合光密度值Sham組26.00±5.36*62.56±25.5*模型組19.25±4.09#30.25±15.5#活血開竅湯Ⅰ組21.75±3.37#42.01±15.6#活血開竅湯Ⅱ組22.50±3.83*#44.67±7.11*#活血開竅湯Ⅲ組23.37±3.46*#46.87±7.03*#

3　討論

腦梗死是指由各種原因引起的腦血流供應障礙，進而造成相應缺血區神經細胞發生不可逆性損傷，出現相應神經功能缺損癥狀的疾病，屬中醫學“中風”、“偏枯”等范疇，也是目前導致人類死亡的第2大病因［5］。該病具有較高的復發率和致殘率，對患者本人及家屬造成了嚴重的精神和經濟負擔。中國每年新發生腦卒中患者數在200萬以上，每年死于腦卒中的人數超過150萬；發生卒中后存活下來的患者多達600～700萬，其中四分之三留有不同程度的后遺癥［6］。

圖1　各組大鼠大腦皮質Claudin-5陽性細胞表達情況Fig.1 Claudin-5 positive cells expression in cerebral cortex in each group of rats

歷代醫家對中風病因病機的認識雖各有偏頗，不同流派見仁見智，但無論是風、火、痰、瘀、虛何種病因所致，其病理變化的最終結局都是脈絡不通、血脈不暢。可以認為血瘀是中風病的根本原因，而“瘀阻腦絡”則是缺血性中風的病理本質。由此可見，“血瘀閉阻，腦竅不通”是中風病的本質病機。因此開竅啟閉，祛除瘀、痰、風等邪氣則為治療中風病的根本大法，活血開竅湯即是基于上述對中風病的基本認識而進行組方用藥的，并為大量臨床實踐證明療效顯著。方中川芎、丹參、牛膝活血祛瘀；郁金祛痰開郁，并有加強活血化瘀的功效；蘇合香開竅辟穢；遠志祛痰開竅，輔以白僵蠶共奏開竅辟穢祛痰之功；天麻、白僵蠶合用以熄風平肝；葛根升陽生津以利腦。諸藥合用，共奏開竅活血祛痰之效。

BBB是一個擴散屏障，由腦的微血管系統和周細胞組成，BBB只允許水和脂溶性小分子自由擴散，對維持中樞神經系統內環境的穩態起著重要的作用［7］。在腦缺血后，血腦屏障受到一定的破壞，其對小分子物質EB的通透性會增加，所以EB滲透率變化是衡量BBB通透性的一個客觀的指標［8］。而血管內皮細胞之間的緊密連接則是形成BBB的關鍵因素［9］，緊密連接使大腦形成了一個擴散屏障，維持了中樞神經系統的穩態。其中，跨膜蛋白Claudin對BBB的緊密連接起著重要作用。Claudin和相鄰內皮細胞的Claudin相互獨特地連接在一起，進而形成了緊密連接的初級封口［10］。當Claudin蛋白出現結構和功能上的障礙時，血腦屏障功能都會隨之改變。而Claudins家族成員，尤其是Claudin-5是決定細胞旁通透性的一個重要因素［11］。所以，本實驗通過觀察MCAO大鼠缺血腦組織Claudin-5蛋白含量及EB滲透率的變化來反應通竅活血湯對大鼠BBB通透性的影響是可行的。

本實驗結果顯示，所有實驗組大鼠缺血區大腦紋狀體中EB含量均低于MCAO模型對照組，表明實驗組各組MCAO模型大鼠BBB的通透性低于模型對照組，由此可推斷，活血開竅湯發揮其神經保護作用的機制與降低大鼠BBB的通透性，最終維持BBB的完整性相關。并且，相關的多項研究［12-14］已證實，活血類藥物對BBB確有一定的保護作用，本研究結果與以上研究結果基本一致。其中，活血開竅湯Ⅱ組和Ⅲ組模型大鼠缺腦血區紋狀體中EB濃度較Ⅰ組降低的更為明顯（P＜0.05），表明急性期使用活血開竅湯對降低BBB的通透性作用并不十分明顯，而在恢復期應用活血開竅湯對大鼠BBB的通透性改善地更為顯著。同時，MCAO模型大鼠缺血側腦組織Claudin-5蛋白表達明顯減少，活血開竅湯組相同區域陽性細胞的表達雖較假手術組偏少，但與MCAO模型對照組相比，Claudin-5陽性細胞的表達量顯著增高（P＜0.05）。并且在活血開竅湯3個亞組中，以Ⅱ組Claudin-5陽性細胞表達最多，亦說明活血開竅湯在非急性期使用比在急性期使用對BBB的保護作用更為明顯。

4　結論

活血開竅湯可通過減輕BBB的通透性，降低缺血區大腦紋狀體中的EB含量，減少Claudin-5蛋白的破壞從而保護MCAO大鼠血腦屏障，但在急性期應用活血開竅湯對BBB的保護作用并不明顯，且尚不能證明在非急性期越早給予活血開竅湯對大鼠BBB的保護作用就越顯著。腦梗死是一個多環節、多途徑的復雜的病理過程，通過研究活血開竅湯對BBB的影響來驗證其對MCAO模型大鼠腦保護作用，為活血開竅湯神經保護作用機制的研究奠定了一定的基礎。而活血開竅湯是否適合在腦缺血急性期使用，以及何時給藥效果最佳等問題還有待于后續深入的研究。

［1］張麗麗.活血開竅湯對大鼠腦缺血再灌注損傷NO含量及細胞凋亡的影響［D］.天津:天津醫科大學，2013.

［2］李明花.活血開竅湯對腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、MDA的影響［D］.天津:天津醫科大學，2013.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occludion without crainectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:8-87，84-91.

［4］Zhu Xu，Li SJ，Hu HH，et al.Neuroprotective effects of Xiao-Xuming decoction against ischemic neuronal injure in vivo and in vitro［J］.J Ethnopharmacol，2010，127（1）:38-46.

［5］常富業，李云，陳燕，等.中風病二級預防中醫藥參與狀況的研究［J］.天津中醫藥，2010，29（2）:99-100

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［14］何平平.腦缺血再灌注損傷對羥基紅花黃色素A透過血腦屏障的研究［D］.濟南：山東大學，2009.

（本文編輯：馬英，滕曉東）

Effects of“Huoxue Kaiqiao”decoction on the behavior and blood-brain barrier in middle cerebral artery occlusion rats

ZHAO Jin-sheng1，2，MENG Fan-zheng1，YIN Yun2，LI Ping3
（1.Department of Neurology，Tianjin Nankai Hospital，Tianjin 300100，China；2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3.Tianjin Third Central Hospital，Tianjin 300170，China）

［Objective］To investigate the time-effect relationship of“Huoxue Kaiqiao”decoction on the behavior and blood-brain barrier（BBB）in middle cerebral artery occlusion rats.［Methods］The 48 MCAO Wistar model rats were randomly divided into model group and“Huoxue Kaiqiao”decoction groups（group I:administration 2 hours after modeling；group II:administration 24 hours after modeling and group III:administration 48 hours after modeling）.Each group contained 12 rats，and another 12 rats made up sham operation group.Zealonga scoring method was used to observe the neurological deficit situation of rats.Two hours before death from intravenous injection of EB solution in order to observe changes in BBB permeability，and another taking fixed brain to detect Claudin-5 protein content by immunohistochemistry method.［Results］Compared with the control group，nerve function were improved in all treatment groups（P＜0.05）. Cerebral ischemic striatum EB in treatment groupⅡandⅢwere lower than the model group（P＜0.05），but the content of Claudin-5 in these groups were high（P＜0.05）.However，the difference was not statistically significant between groupⅡand groupⅢ，and between group I and model group（P＞0.05）.［Conclusion］Resuscitation promoting blood circulation by reducing BBB permeability soup can reduce damage Claudin-5 protein in rat brain barrier to protect MCAO，but the protective effect in the acute phase of the BBB is not obvious，and yet could not prove that in the non-acute phase sooner promoting blood circulation giving resuscitation BBB decoction of the more remarkable.

“Huoxue Kaiqiao”decoction；MCAO；blood-brain barrier；Claudin-5 protein

R743.32

A

1672-1519（2015）11-0679-05

天津市科技攻關項目（05YFSZSF02600）。

趙金生（1986-），男，博士研究生，住院醫師，主要從事中西醫結合腦血管病的防治和循證醫學研究工作。

李平，E-mail：lipingtjutcm@sina.com。

（2015-05-29）