補骨脂酚對小鼠肝功能和膽汁酸轉運體BSEP、NTCP的影響*

畢亞男，李　震，周　昆，趙雪言，史　紅，鄭　林

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，方劑學教育部重點實驗室，天津300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193）

·實驗研究·

補骨脂酚對小鼠肝功能和膽汁酸轉運體BSEP、NTCP的影響*

畢亞男1，李震2，周昆1，趙雪言1，史紅1，鄭林1

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，方劑學教育部重點實驗室，天津300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193）

［目的］觀察補骨脂酚對小鼠肝功能和膽汁酸轉運體膽鹽輸出泵（BSEP）、鈉牛磺酸膽酸共轉移蛋白（NTCP）的影響。［方法］小鼠連續14 d皮下注射50 mg/kg補骨脂酚和10 mg/kg α-雌二醇，分別在給藥1、3、7、14 d后處死部分小鼠取材，檢測血清生化，剖取肝臟稱質量并進行肝臟病理組織學檢查，取新鮮肝臟用酶聯免疫吸附法（ELISA法）檢測BSEP、NTCP的蛋白表達。［結果］補骨脂酚和α-雌二醇對小鼠體質量沒有明顯影響。α-雌二醇皮下注射14 d會使小鼠血清谷丙轉氨酶（ALP）升高、肝臟腫大、肝系數升高，而補骨脂酚無此作用，但給藥期間補骨脂酚可導致血清ALP一過性降低，14 d時恢復正常。補骨脂酚對肝臟BSEP基本沒有影響，而會導致NTCP逐漸升高，給藥14 d時NTCP顯著高于溶劑組。給藥14 d，補骨脂酚組小鼠肝臟無病變，而α-雌二醇組小鼠肝臟存在肝細胞變性。［結論］50 mg/kg補骨脂酚給藥14 d未見肝臟毒性，而10 mg/kg α-雌二醇肝毒性明顯。

補骨脂酚；小鼠；膽鹽輸出泵；鈉牛磺酸膽酸共轉移蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.08

補骨脂酚是補骨脂中含量最高的成分，屬于單萜酚類成分在藥材中含量為1.12%～5.149%［1-2］，占揮發油的60%以上［3］，遠大于補骨脂素和異補骨脂素0.4%的含量水平［4-5］。有研究發現補骨脂酚對KH-2細胞有顯著毒性［6］，而課題組前期研究也表明補骨脂酚對HepG2細胞也有明顯毒性，自2005年開始有多起報道補骨脂引起的肝損害［7-9］，實驗室有結果顯示補骨脂對肝臟會造成損傷［10-13］，那么補骨脂酚是否會與補骨脂的肝毒性有關，報道中補骨脂引起的肝損害多有膽汁淤積的表現，可能與其影響了膽汁酸的轉運有關，這與雌激素引起的肝損害很相似［14］。本研究在ICR小鼠連續皮下注射給予觀察補骨脂酚對小鼠肝功能和肝臟中膽鹽輸出泵（BSEP，ABCB11）、鈉牛磺酸膽酸共轉移蛋白（NTCP，SLC10A1）表達的影響，并設了α-雌二醇作為陽性對照，初步考察補骨脂酚的毒性及其對膽汁酸轉運體是否有影響。

1　材料

1.1受試藥補骨脂酚，經高效液相色譜法（HPLC）檢測純度＞95%，購自天津月牙湖科技有限公司。

1.2細胞ICR小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。

1.3試劑與儀器α-雌二醇（TCI），谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、膽汁酸（TBA）全自動生化儀檢測試劑盒（Biosino），BCA蛋白測定試劑盒（Beyotime），BSEP和NTCP試劑盒（Cusabio），1，2丙二醇（天津市江天化學技術有限公司），生理鹽水（辰欣藥業）。

Legend Micro17離心機為Thermo公司產品，7020全自動生化儀為日立公司產品，脫水切片機均為Lecia公司產品，光學顯微鏡為Olympus產品，InfiniteM200多功能酶標儀為Tecan公司產品。

2　方法

2.1動物分組及給藥100只小鼠，按隨機數字表法隨機分為4組，即對照組10只、溶劑組40只，補骨脂酚50 mg/kg組40只，α-雌二醇10 mg/kg組10只。參照文獻中雌二醇的給藥方式［14］，補骨脂酚和α-雌二醇在實驗前用溶劑（80%的1，2丙二醇生理鹽水液）進行溶解后供皮下注射使用。各組每日按5 mL/kg皮下注射給藥1次，對照組以飲用水灌胃，連續14 d。

2.2小鼠肝功能、病理組織學及BSEP和NTCP的檢測分別在1、3、7 d給藥結束，各取溶劑組和補骨脂酚組小鼠各10只進行實驗，剩余小鼠在給藥14 d后進行實驗。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，自眼眶取血，3 000 r/min離心分離血清，檢測血清中ALT、AST、ALP、TBA。取相同部位肝臟一葉，用12%甲醛液固定，常規石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡下進行病理組織學檢查。取新鮮肝臟用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制備肝勻漿并檢測總蛋白濃度，將肝勻漿稀釋適當倍數，參照酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書，檢測小鼠肝臟中BSEP、NTCP蛋白濃度。

2.3統計學處理SPSS 18.0統計軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1補骨脂酚皮下注射不同時間對小鼠體質量及肝臟的影響補骨脂酚和α-雌二醇連續給藥對小鼠體質量沒有明顯的影響，補骨脂酚和α-雌二醇連續給藥14 d小鼠體質量與溶劑組均無統計學差異，見表1。連續給藥14 d，補骨脂酚對小鼠肝系數并無顯著影響，而α-雌二醇組小鼠肝系數顯著高于對照組（P＜0.05），見圖1。

表1　給藥不同時間小鼠體質量的變化（±s）g

表1　給藥不同時間小鼠體質量的變化（±s）g

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圖1　給藥14 d小鼠肝系數

補骨脂酚50 mg/kg連續給藥期間，小鼠血清中ALP有一過性降低，在給藥3 d和7 d均顯著低于溶劑組，14 d補骨脂酚組小鼠ALP與溶劑組并無統計學差異，而α-雌二醇10 mg/kg連續給藥14 d，可使小鼠血清ALP顯著升高。血清中AST、ALT和TBA的變化并不顯著，見表2-5。

連續給藥14 d，對照組小鼠肝細胞排列整齊，肝索清晰，肝細胞無變性壞死。溶劑組小鼠肝臟無明顯病理變化。補骨脂酚組小鼠肝臟肝索清晰，未見明顯病理改變，而α-雌二醇組小鼠可見肝臟的肝小葉中央區域肝細胞明顯腫脹變性、排列紊亂，見圖2。

圖2　給藥14 d典型病理照片（HE染色×200）

表2　給藥不同時間血清AST的變化（±s）U/L

表2　給藥不同時間血清AST的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 153.0±46.7166.5±40.6 165.8±44.0 214.2±44.9補骨脂酚組5010 153.5±41.5159.1±50.3 197.7±67.5 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表3　給藥不同時間血清ALT的變化（±s）U/L

表3　給藥不同時間血清ALT的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 31.2±05.2 50.3±29.1 38.9±14.4 214.2±44.9補骨脂酚組5010 30.5±10.8 34.6±09.6 35.9±05.9 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表4　給藥不同時間血清ALP的變化（±s）U/L

表4　給藥不同時間血清ALP的變化（±s）U/L

注：與溶劑組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---123.1±22.4溶劑組-10 168.6±56.1 130.3±31.7158.6±53.1 108.0±38.2補骨脂酚組5010 125.9±36.8 84.0±19.3**111.6±25.7*115.0±33.4 α-雌二醇組1010---252.9±50*

表5　給藥不同時間血清TBA的變化（±s）μmol/L

表5　給藥不同時間血清TBA的變化（±s）μmol/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---26.00±10.98溶劑組-10 21.88±4.70 19.23±9.64 23.64±13.70 30.02±21.00補骨脂酚組5010 19.43±8.78 22.41±9.99 17.27±6.29 22.63±14.20 α-雌二醇組1010---21.90±12.30

3.2補骨脂酚皮下注射不同時間對BSEP和NTCP的影響補骨脂酚50 mg/kg連續皮下注射14 d小鼠，小鼠肝臟中BSEP蛋白表達變化并不明顯，給藥1、3、7、14 d與溶劑組均無顯著差異；而NTCP蛋白表達隨著給藥時間的延長有升高的趨勢，給藥14 d時顯著高于溶劑組（P＜0.05），見圖3。

圖3　給藥不同時間肝臟BSEP和NTCP蛋白表達

4　討論

已經有多個研究證實補骨脂酚在體外有十分明顯的細胞毒性，對于HepG2、A549、MCF-7、DU-145、THP-1等多個腫瘤細胞增殖有顯著抑制作用［15-17］，而在體內卻基本沒有抗腫瘤研究報道，同時補骨脂酚的體內安全性研究沒有報道，這可能是因為補骨脂酚的生物利用度很低的原因［18］。筆者沒有觀察到補骨脂酚對小鼠有明顯的肝毒性表現，有研究認為補骨脂酚可以減輕四氯化碳（CCl4）等造成的肝損害［19］，但其保護機制尚不明了。

50 mg/kg補骨脂酚給藥14 d，沒有明顯影響BSEP，但NTCP卻顯著升高了。BSEP和NTCP是肝細胞膜上最重要的兩個膽汁酸轉運蛋白，BSEP將膽汁酸由肝細胞轉運至細胞間膽管，NTCP將膽汁酸從血液轉運至肝細胞，在非膽道系統出現機械性梗阻的情況下，這兩個轉運蛋白的變化很大程度上影響著血液和肝細胞內膽汁酸的平衡，單純的NTCP升高可能致使肝細胞內膽汁酸濃度異常升高。膽汁酸由肝細胞合成分泌，通過各級管道最終分泌到十二指腸，幫助進行脂肪消化，膽汁酸性極強，在細胞內濃度過高可通過線粒體介導導致細胞凋亡，從而導致毒性產生［20］。補骨脂酚影響了小鼠肝臟內膽汁酸轉運體的表達，使肝細胞內存在膽汁酸濃度過高的可能，但病理檢查并未發現病變，這可能是肝細胞膜上其他轉運體也同時發生改變，最終肝細胞內膽汁酸處于一個比較穩定的水平，也可能是因為補骨脂酚作用時間較短，未能體現出明顯毒性。

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Influence of Bakuchiol on liver function and bile acid transporters BSEP and NTCP in mouse

BI Ya-nan1，LI Zhen2，ZHOU Kun1，ZHAO Xue-yan1，SHI Hong1，ZHENG Lin1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the influence of bakuchiol on liver function and bile acid transporters in mice.［Methods］Mice were treated with 50 mg/kg Bakuchiol and 10 mg/kg-estradiol continuously for 14 d.At 1，3，7 and 14 d，mice were divided into several parts to kill.The material from mice killed was for serum biochemical indicators testing.Then mice livers were taken weight and carry on the liver histologic examination and take fresh liver to detect BSEP，NTCP protein expression with ELISA method.［Results］Bakuchiol and α-estradiol had no significant effect on body weight in mice.The subcutaneous injection of α-estradiol for 14 d made mice elevated serum ALP，hepatomegaly，liver coefficient increased，but the Bakuchiol didn't.ALP decreased for the time of the Bakuchiol injection，after 14 d back to normal.Bakuchiol had no effect on the liver BSEP mostly，and would result in higher NTCP gradually，for 14 d NTCP group was significantly higher than the solvent.After 14 d treatment，Bakuchiol groups of mice liver lesions，and α-estradiol group mice liver had cell degeneration.［Conclusion］Bakuchiol treatment for 14 d does not induce liver injury，but hepatotoxicity of α-estradiol is obvious.

Bakuchiol；mice；BSEP；NTCP

R285.5

A

1673-9043（2015）04-02222-04

國家自然科學基金項目（81202991）。

畢亞男（1987-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學研究工作。

周昆，E-mail：z.k.ken@263.net。

（2015-03-19）