IGF2BP3低甲基化與結腸癌組織分化的關系

常江，王穎，柳利，王滿倉Δ

IGF2BP3低甲基化與結腸癌組織分化的關系

常江1，王穎2，柳利1，王滿倉1Δ

目的 探討IGF2BP3低甲基化與結腸癌組織分化之間的關系。方法 收集2011年3月—8月在我院就診的結腸癌組織標本41例，其中高分化腺癌19例，中分化腺癌12例，低分化腺癌10例，同時收集結腸炎標本12例作為對照。免疫組化和Western blot檢測標本IGF2BP3表達。改進ELISA法檢測標本DNA總甲基化水平，甲基化特異性PCR（MS-PCR）檢測IGF2BP3甲基化水平。結果 免疫組化和Western blot結果示結腸癌組織IGF2BP3表達高于結腸炎組織（P＜0.05），低分化結腸癌組IGF2BP3表達水平最高，中、高分化程度間表達無明顯差異。結腸癌組基因總甲基化水平和IGF2BP3甲基化水低于結腸炎組（均P＜0.05），且隨著結腸組織分化程度降低，IGF2BP3甲基化水平依次降低（P＜0.05）。結論 IGF2BP3甲基化水平與結腸癌分化程度密切相關，在調控結腸癌組織IGF2BP3表達中具有重要價值。

胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白3；結腸癌；DNA甲基化；分化；免疫組織化學；甲基化特異性PCR

胚胎發育過程中胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白3（IGF2BP3）在RNA轉位、固定、細胞生長及細胞遷移中扮演重要角色［1］。研究發現IGF2BP3在胰腺癌、肺癌、食管癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤組織中表達［2］。有研究證實IGF2BP3與結腸癌等腫瘤的預后相關，但IGF2BP3在結腸癌分化中的作用及機制尚不清楚［3］。目前通過表觀遺傳學尤其是DNA甲基化探索結腸癌發病機制已成為研究熱點［4］。鑒于此，本研究擬通過觀察IGF2BP3甲基化在不同分化結腸組織中的表達，探討IGF2BP3甲基化與結腸癌分化程度的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2011年3月—8月內蒙古巴彥淖爾市醫院普外一科手術切除的結腸癌組織標本41例，所有標本均經病理形態學檢查證實，臨床病理資料完整。年齡：≤60歲19例，＞60歲22例。性別：男25例，女16例。腫瘤最大徑：＞5 cm 13例，≤5 cm 28例。分化程度：低分化10例，中分化12例，高分化19例。腸壁浸潤程度：T1+T2 6例，T3+T4 35例。淋巴結轉移：無轉移19例，有轉移22例。遠處轉移：無轉移32例，有轉移9例。TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期17例，Ⅲ期+Ⅳ期24例。收集同期12例結腸鏡活檢結腸炎標本作為對照。

1.2 主要試劑 IGF2BP3鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠二抗及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），DNA提取試劑盒與PCR試劑（Promega生物技術有限公司），基因組總甲基化檢測試劑盒（美國Epigentek公司），DNA甲基化修飾試劑盒（美國ZYMO公司），BCA蛋白定量試劑盒（凱基生物科技發展有限公司）。

1.3 免疫組化 4%甲醛溶液固定標本，常規石蠟包埋后，4 μm連續切片，然后進行HE染色和免疫組化染色。免疫組化采用SP法，使用枸櫞酸鈉緩沖液進行高壓修復5 min，3% H2O2通透10 min，10%山羊血清封閉30 min，滴加IGF2DP3一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，DAB顯色后蘇木精復染，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖像。IGF2BP3的陽性表達指數用染色強度分數×染色細胞比例分數表示。染色強度按顏色評分:完全陰性0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細胞染色百分比＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別計0、1、2、3、4分。同時采用Image-Pro Plus 5.0對IGF2BP3陽性細胞的平均光密度值進行定量分析。

1.4 Western Blot檢測IGF2BP3蛋白表達 取各組織標本100 mg，加500 μL蛋白裂解液提取標本總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔40 μg蛋白行SDS-PAGE，100 V濕轉1 h將蛋白轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，以β-actin為內參，PBS洗膜后加入一抗（1∶200）4℃過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG（1∶3 000），室溫孵育1 h，化學發光法顯影、曝光，UVI凝膠成像系統成像，Image-Pro Plus 5.0進行灰度值分析，計算蛋白相對表達量。

1.5 DNA總甲基化水平檢測 取20 mg組織標本提取DNA，紫外分光光度計測定濃度后取200 ng DNA檢測總甲基化水平。操作步驟嚴格按照說明書執行。實驗結束后酶標儀檢測各標本在450 nm處的光密度（OD）值，根據如下公式計算基因組甲基化水平，公式中X=41%是指人類基因組中GC的平均含量。Methylation%=［（SampleOD-NegativeControlOD）/X］/［（PositiveControlOD-NegativeControlOD）］×100%。

1.6 基因組DNA亞硫酸鹽修飾 取純化的標本DNA 500 ng用于亞硫酸鹽修飾，嚴格按照操作說明書執行。標本經過結合、脫硫、洗脫等步驟后可獲得10 μL亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA，用于后續PCR反應。經修飾后的基因組DNA，非甲基化胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），在PCR反應中擴增為胸腺嘧啶（T），而5甲基胞嘧啶（5-mC）不變。

1.7 IGF2BP3基因甲基化水平檢測 應用甲基化特異性PCR（MS-PCR）進行檢測，Meth Primer軟件設計IGF2BP3引物序列并委托Invitrogen公司合成。IGF2BP3甲基化引物：上游5′-AAAGGGGATTTAGGTTACGGTCATA-3′，下游5′-CCATAAAAAAAAACAAAAACTAAACG-3′，產物長度165 bp；IGF2BP3非 甲 基 化 引 物 ：上 游 5′-ATATGG TTAGAAAGGGTTTAGGTGA-3′，下游 5′-CCATAAAAACAAAAACTAAAAAAACAC-3′，產物長度為164 bp。PCR反應體系：GoTaq?GreenMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 4 μL，無核酸酶H2O 6.5 μL。反應條件：94℃預變性2 min；94℃30 s，67℃10 s，72℃30 s，35個循環；72℃10 min。凝膠成像系統測量目的片段灰度值，以甲基化條帶灰度值/非甲基化條帶灰度值計算樣本甲基化水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。非正態分布數據進行數據變換后，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化 IGF2BP3定位于細胞漿，呈淡黃色、黃色或棕黃色，見圖1。與結腸炎（A）組相比，結腸癌組織中IGF2BP3表達升高（均P＜0.05），且低分化（D）組高于高分化腺癌（B）組和中分化（C）組（均P＜0.05），中分化組與高分化組表達差異無統計學意義。光密度值法分析結果與積分法結果一致，見表1。

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化結腸組織IGF2BP3陽性表達指數與平均光密度值比較 （±s）

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化結腸組織IGF2BP3陽性表達指數與平均光密度值比較 （±s）

＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05，圖2～4同

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Fig.1 The expression of IGF2BP3 in colon tissues with various differentiations（×200）圖1 不同分化結腸組織IGF2BP3表達（×200）

2.2 IGF2BP3蛋白表達水平 與結腸炎組相比，結腸癌組織IGF2BP3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。低分化結腸癌組IGF2BP3表達高于高分化和中分化組（P＜0.05），中、低分化組間表達無明顯差異，見圖2。

Fig.2 The expressions of IGF2BP3 protein in colon tissue with various differentiations圖2 不同分化結腸組織IGF2BP3蛋白表達水平

2.3 IGF2BP3基因甲基化水平 結腸炎組IGF2BP3甲基化水平高于其他3組（P＜0.05）。結腸癌組織IGF2BP3甲基化水平隨組織分化程度的降低依次降低（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 IGF2BP3 methylation status of colon tissue with various differentiations圖3 不同分化結腸組織IGF2BP3甲基化水平

2.4 不同分化結腸組織基因組總甲基化水平 結腸炎組織基因總甲基化水平高于其他3組（P＜0.05），低分化腺癌低于高分化和中分化腺癌（P＜0.05），而高分化與中分化腺癌甲基化水平無明顯差異，見圖4。

Fig.4 The global methylation status of colon tissue with various differentiation圖4 不同分化結腸組織基因組總甲基化水平

3 討論

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發病率位列所有腫瘤第3位，2013年，美國9%的腫瘤患者死于結腸癌［5］，我國目前無相關的流行病學數據。因其死亡率較高，為更好判斷腫瘤的診斷和預后，特異性生物標志物成為結腸癌研究的重要方向。目前ColoVantage和ColoSure等DNA甲基化標志物已經應用于臨床實踐，指導結腸癌診斷和預后判斷［6］。腫瘤的發生過程伴隨原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化。既往的結腸癌生物標志物大多聚焦于抑癌基因甲基化研究，有關原癌基因甲基化修飾在結腸癌分化中的作用研究較少。IGF2BP3是RNA結合、癌胚蛋白保守家族成員，在細胞增殖、遷移、代謝及分化中具有重要作用。

目前諸多研究支持IGF2BP3作為一種原癌基因參與腫瘤的發生發展［7］。體外培養肺癌和乳腺癌細胞中過表達IGF2BP3可增加細胞侵襲性［8］。在小鼠黑色素瘤模型中，黑色素瘤細胞過表達IGF2BP3可促進腫瘤生長，血管生成及轉移［9］。臨床研究發現IGF2BP3是結腸癌病理分型和預后判斷的重要標志物［10-11］。本研究發現在不同分化程度的結腸癌組織中均有IGF2BP3表達，且在低分化組織中，其表達量較高，與上述研究結果相一致。基因組總甲基化水平降低是細胞增殖水平升高的重要表現。本研究顯示結腸癌組織基因總甲基化水平低于結腸炎組織，且低分化組織總甲基化水平低于高分化和中分化組織。有研究采用LINE-1甲基化作為基因組總甲基化水平的指示因子，發現LINE-1低甲基化與結腸癌組織分化和預后相關，且LINE-1低甲基化與IGF2BP3高表達和結腸癌預后不良相關［12］。本研究發現，結腸炎組織IGF2BP3甲基化水平高于其他結腸癌組織，且隨著分化程度減低，IGF2BP3甲基化水平逐漸減低，提示IGF2BP3低甲基化是IGFBP3表達升高的主要原因，與結腸組織分化密切相關。高分化和中分化結腸癌組織兩組之間無明顯差異，可能與樣本量相對較少和存在選擇偏倚有關。IGF2BP3低甲基化可能成為一種新的判斷結腸癌分化和預后的重要生物學標志物，在表觀遺傳學迅猛發展的大背景下，具有廣泛的應用前景。一方面需進一步探索IGF2BP3低甲基化調控其表達的機制；另一方面，需要更多的臨床研究去求證IGF2BP3低甲基化用于結腸癌早期診斷、預后評估的科學性和可行性。

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（2014-10-16收稿 2015-01-07修回）

（本文編輯 胡小寧）

The relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation

CHANG Jiang1，WANG Ying2，LIU Li1，WANG Mancang1Δ
1 Department of General Surgeon，2 Department of Nephrology，Inner Mongolia Bayannaoer City Hospital，Inner Mongolia 015000，China
ΔCorresponding Author E-mail:rh6917@aliyun.com

Objective To investigate the relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation.Methods Tissue samples from 41 colorectal cancer were collected from March 2011 to August 2011 in our hospital，among which 19 cases were well-differentiated adenocarcinoma，12 cases were of moderately differentiated adenocarcinoma and 10 cases were of poorly differentiated adenocarcinoma.Meanwhile biopsy samples from 12 cases of colonic colitis were collected as a control.The expression of IGF2BP3 was assessed by immunohistochemistry and Western blot.An innovate of ELISA technique was used to examine global methylation levels while IGF2BP3 methylation level was tested by methylation specific PCR technique.Results The expressions of IGFBP3 are higher in all colon cancer groups than that in colitis（P＜0.05）.The expression of IGFBP3 in poorly differentiated adenocarcinoma is higher than that in all the other groups，but there is no significant difference between its expressions in the well differentiated group and in the moderately differentiated adenocarcinoma group.The global DNA level and IGFBP3 methylation level of every colon cancer group is lower than those in colitis（P＜0.05）.Also，a tendency of decreasing global DNA and IGFBP3 methylation status was observed comparing well differentiated towards poorly differentiated carcinomas（P＜0.05）.Conclusion IGF2BP3 expression in colorectal cancer is associated with differentiation of colon cancer tissue.A lower global and IGF2BP3 DNA methylation suggest a worse differentiation of colon cancer.DNA hypomethylation may therefore play a regulatory role in the expression of IGF2BP3 in colon cancer tissue.

IGF2BP3；colonic neoplasms；DNA methylation；differentiation；immunohistochemistry；methylation-specific PCR

R735.3

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.017

1內蒙古自治區巴彥淖爾市醫院普外科（郵編015000），2腎內科

常江（1977），研究生，主治醫師，主要從事胃腸道腫瘤的防治研究

E-mail:rh6917@aliyun.com