過表達谷氧還蛋白基因GRX5提高釀酒酵母乙酸耐性

方青，張明明，陳洪奇，熊亮，趙心清，白鳳武,

（1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116023；2 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

引 言

清潔能源燃料乙醇是重要的石油替代品，具有良好的發展前景[1-2]。以來源豐富且廉價的纖維質農林廢棄物為原料生產燃料乙醇，是國內外生物能源發展的重要方向。但是，木質纖維素原料在預處理過程中可產生對細胞生長和代謝具有毒性的副產物，包括弱酸類、醛類和酚類等[3-4]。此外，利用酵母生產有機酸、維生素、酵母粉等商業產品過程中也會產生弱酸，抑制目標產物的積累[5]。乙酸作為主要的毒性副產物之一，能引起細胞內環境的酸化，從而對酵母細胞的生長和代謝都具有較強的抑制作用[3,6]，其毒性不僅包括pKa依賴的陰離子抑制作用，其造成的低pH 對細胞也產生損傷[7]。雖然可通過提高pH 緩解乙酸對細胞的毒性，但對于大規模生產，大量使用堿液會影響生產的經濟性，增加操作的復雜性[8]。國內外利用代謝分析和遺傳育種，已經對乙酸耐性的分子機理進行了較為深入的研究，獲得了耐性提高的釀酒酵母菌株[3,5-6,9]。

谷胱甘肽依賴的氧化還原酶（GRX5p）是谷氧還蛋白亞家族成員之一，位于線粒體基質內，由GRX5基因編碼，參與Fe/S 中心的合成與裝配[10]。有研究表明，釀酒酵母細胞中乙醇誘發的活性氧（ROS）的產生與Fe/S 中心簇合成與裝配系統異常密切相關，在釀酒酵母細胞中敲除GRX5基因導致 ROS 含量明顯增加[11]。GRX5p 能夠響應過氧化氫及超氧化物的脅迫作用，在細胞抗氧化作用中發揮重要作用[10,12-13]。此外，有文獻報道其能與全局轉錄因子SPT10p 結合，在轉錄水平中起到調控蛋白表達的作用，通過調控耐性相關蛋白的表達來提高酵母細胞的脅迫耐受性[14]。但是，GRX5過表達對釀酒酵母乙酸耐性的影響目前還不清楚。本課題組在前期蛋白組研究中發現，乙醇發酵過程中細胞活性較好的樣品中GRX5p 的蛋白表達量較高，因此本文研究了過表達GRX5對釀酒酵母乙酸耐受性的影響，為進一步選育高效工業乙醇酵母提供了參考。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種

大腸桿菌DH5α，釀酒酵母模式菌株S288C（瑞典查爾姆斯理工大學Jens Nielsen 教授惠贈），工業釀酒酵母Sc4126，本實驗室保存。

1.2 培養基

LB 培養基（g·L-1）：酵母粉5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0；液體YPD 培養基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20；斜面培養基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉 4，蛋白胨 3，瓊脂粉 20；種子培養基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉4，蛋白胨 3；發酵培養基（g·L-1）：葡萄糖 100，酵母粉 4，蛋白胨 3，乙酸 5；固體YPD 培養基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，瓊脂粉 20；乙酸耐性檢測培養基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，瓊脂粉 20，乙酸 5。

1.3 過表達菌株構建

以釀酒酵母S288C 基因組為模板，通過PCR擴增獲得目的基因，所用上游引物為GRX5-F(5′-CTCCCGGGATGTTTCTCCCAAAATTCAATC-3′)，下 游 引 物 為 GRX5-R (5′-CCTTAATTAATCAACGATCTTTGGTTTCTTCT-3′)。將所得目的基因片段與pHO 整合表達載體[15]連接后轉化到大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，利用氨芐抗性平板篩選轉化子。將驗證正確含有目的基因的質粒經NotⅠ酶切線性化后電轉化到宿主酵母中，通過G418 抗生素篩選得到多個該目的基因過表達的陽性釀酒酵母重組菌株。挑取轉化子單菌落富集培養后提取的基因組，利用引物GRX5-F 和G418-R（5′-AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAG-3′）進 行PCR 初步驗證。大腸桿菌轉化子篩選和培養加入氨芐青霉素，終濃度為100 μg·ml-1；酵母菌轉化子的篩選采用G418，終濃度為200 μg·ml-1(S288C 宿主) 或300 μg·ml-1（Sc4126 宿主）。

1.4 菌種活化、耐性檢測及乙醇發酵

1.4.1 菌種活化 從斜面上接一環含有空載體的對照菌株HO-Sc4126 及含有目的基因的過表達菌株HO-GRX5-Sc4126 至種子培養基中，30℃，150 r·min-1過夜培養，至生長對數期時進行下一步實驗。

1.4.2 重組菌株的耐性檢測 在固體YPD 培養基滅菌后添加5 g·L-1乙酸，制備乙酸耐性檢測平板。將菌株活化培養液的OD620調至一致（1.5～2.0），10 倍梯度稀釋，取2 μl 點樣于乙酸耐性檢測平板，30℃培養2～4 d，在菌株充分生長后拍照，具體方法參見文獻[16]。

1.4.3 乙酸脅迫下的乙醇發酵 發酵實驗所用菌株為HO-Sc4126 對照菌株及其GRX5過表達菌株。發酵培養基在滅菌后添加終濃度為5 g·L-1的乙酸，比較空載體菌株和GRX5過表達菌株乙酸脅迫條件下的生長和乙醇發酵。發酵方法如下：菌株經活化后用種子培養基調OD620至一致（1.5～2.0），按10%（體積）接種量轉接到含100 ml 發酵培養基的250 ml 搖瓶中，于30℃和150 r·min-1條件下進行發酵。發酵過程中每6～12 h 定時取樣，測定乙醇產量、殘糖及生物量，每批實驗重復3 次，得到一致的結果。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖濃度、乙醇濃度、生物量及代謝物的測定 發酵過程中葡萄糖濃度、乙醇濃度和生物量均按照文獻[2]進行測定。

乙醇得率（YE/CS）由式（1）計算

式中，[ethanol]max為發酵過程中最大乙醇濃度，[sugar]consumed為發酵所消耗的糖。

生物量得率(YB/CS) 用式（2）計算

式中，[biomass]max表示發酵過程積累的最大生物量(干重)。實驗組的乙醇得率和生物量得率都以對照組的百分數表示。

乙醇生產強度（YE/T）為發酵過程中最高乙醇濃度與達到這一產值所需時間的比值。

比乙醇生成速率（P）用式（4）計算

式（4）中生物量biomass 為細胞干重。

代謝物測定選擇3 個不同時期（對數期，靜止期，衰亡期），其對應的不同時間如表1所示。

表1 不同時期對應的不同發酵時間Table 1 Different phase corresponds to different time

發酵液中的代謝物分析采用Waters 1525 高效液相色譜（Waters,MA,USA）系統，裝配Aminex HPX-87H 有機酸分析柱（300 mm×7.8 mm,Hercules,Bio-Rad）和示差檢測器(Waters 410)。進樣量20 μl，流動相為0.005 mol·L-1的H2SO4溶液，流速0.5 ml·min-1，示差檢測器溫度50℃，柱溫50℃。

1.5.2 遺傳穩定性分析 將待測菌 HO-GRX5-Sc4126 在YPD 斜面上活化后，按文獻方法分析其遺傳穩定性[17]。

1.6 RNA 提取及實時定量分析

采用Sangon Biotech 試劑盒提取在1.4.3 中所述乙酸脅迫條件下發酵過程中重組菌 HO-GRX5-Sc4126 和對照菌HO-Sc4126 對數生長期細胞的總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒方法將提取的RNA反轉錄為cDNA；Real-Time PCR 參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒方法進行，將所得數據進行基因相對表達量的分析。目的基因引物分別為rt-GRX5-F（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）和 rt-GRX5-R（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）；以管家基因ACT1作為內參，引物及序列分別為ACT1-F（5'-ACCATGTTCCCAGGTATTGC-3′）和ACT1-R (5′-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3′)。

2 實驗結果與討論

2.1 過表達GRX5 對釀酒酵母細胞乙酸耐性的影響

為了研究谷氧還蛋白基因的過表達是否能提高釀酒酵母細胞的乙酸耐受性，構建了GRX5基因過表達的重組菌株，提取重組酵母的基因組DNA經過PCR 驗證，證實重組菌株構建成功（結果未顯示）。遺傳穩定性分析結果顯示在無抗生素培養基傳代5 次后，隨機挑選的100 個單菌落中有97 個仍可在含抗生素的平板上正常生長，說明所得重組菌株遺傳穩定性良好。同時比較了過表達GRX5菌株與對照菌株在5 g·L-1乙酸脅迫條件下的生長狀況，結果見圖1。

由圖1(a) 可以看出，以工業釀酒酵母Sc4126為宿主的重組釀酒酵母HO-GRX5-Sc4126 菌株在含乙酸的平板上生長明顯優于對照菌株，即在Sc4126宿主中過表達GRX5能顯著提高其對5 g·L-1乙酸的耐受性。考慮到這種耐受性可能源于宿主遺傳背景的影響，進一步研究了在模式酵母S288C 中過表達GRX5基因，發現在該宿主背景下，如圖1(b) 所示過表達菌株較對照菌株亦具有更好的乙酸耐受性，證明GRX5的過表達提高乙酸耐性的表型可能適用于多種釀酒酵母。

圖1 不同宿主中過表達GRX5 菌株與對照菌株在正常條件及5 g·L-1 乙酸脅迫條件下的生長狀況Fig.1 Growth performance of GRX5 overexpression strain and control strain under 5 g·L-1 acetic acid stress condition and control condition (All experiments were carried out in triplicates and the same pattern was observed.Data from one representative experiment are shown)

2.2 乙酸脅迫條件下GRX5 表達水平分析及重組菌發酵性能與對照菌的比較

取乙酸脅迫條件下的重組菌和對照菌細胞進行實時定量PCR 分析，結果顯示，重組菌株中GRX5基因的相對表達量是對照菌株的 1.87 倍（1.87±0.06，p＜0.001，n=3），表明GRX5基因的確在重組菌株中過表達。為了進一步驗證重組菌株在脅迫條件下的發酵能力，實驗測定了工業釀酒酵母Sc4126為宿主的重組釀酒酵母HO-GRX5-Sc4126菌株在5 g·L-1乙酸脅迫下的發酵性能。

2.2.1 過表達GRX5對乙酸脅迫下發酵性能的影響 乙酸脅迫條件下細胞生長和乙醇發酵結果如圖2所示。在乙酸脅迫條件下，過表達GRX5的菌株最高OD620為3.30，而含空載體的對照組最高OD620為2.61，過表達菌株遠高于對照菌株，在5 g·L-1乙酸脅迫條件下仍能維持較好的生長。過表達GRX5菌株在24 h 后開始進入對數期，而對照組則是在36 h 后才進入對數期，過表達菌株明顯早于對照菌株，證明過表達GRX5能縮短乙酸脅迫條件下的停滯期[圖2(a)]。

圖2 HO-Sc4126 與HO-GRX5-Sc4126 菌株在5 g·L-1 乙酸下的生長狀況、殘糖及乙醇Fig.2 Cell growth,residual sugar and ethanol production of yeast strains under 5 g·L-1 acetic acid stress condition

殘糖及乙醇數據如圖2(b)，過表達菌株在48 h內基本消耗盡所有的葡萄糖，而對照組完全消耗則需要60 h，過表達GRX5菌株的發酵時間縮短了12 h。同時，過表達菌株的終點乙醇濃度高于對照菌株，分別為43.05 g·L-1和41.88 g·L-1，并且過表達菌株乙醇生成速率遠快于對照菌株。可見，過表達GRX5縮短了該釀酒酵母在乙酸存在下的發酵周期，提高了其發酵性能。表2比較了不同菌株的乙醇發酵性能。重組菌株乙醇得率為0.431 g·g-1，相對于對照菌株的0.428 g·g-1，雖然并無顯著差異，但其發酵時間為48 h，較對照菌株的60 h 縮短了12 h，乙醇生產強度達到0.897 g·L-1·h-1，明顯高于對照菌株的0.698 g·L-1·h-1，提高了約28.5%。重組菌株的乙醇比生成速率為0.209 g·(g DCW)-1·h-1，對照菌株的乙醇比生成速率為0.206 g·(g DCW)-1·h-1，二者細胞發酵活性相當。

2.2.2 過表達GRX5對乙酸脅迫下發酵液中代謝物的影響 為了研究過表達GRX5基因對乙酸脅迫條件下的代謝物的影響，實驗對發酵液中幾種代謝物進行了測定，并根據生物量的變化選擇了3 個不同時期進行比較。

圖3(a) 為發酵液中海藻糖的比較。在不同時期，過表達GRX5的重組釀酒酵母菌株分泌的海藻糖均高于對照菌株，海藻糖本身具有保護細胞的作用，這可能與重組菌株較高的乙酸耐性有關[18]。圖3(b)則顯示無論是在靜止期、對數期還是在衰亡期，過表達GRX5菌株較對照菌株而言，胞外琥珀酸濃度更高，這可能與其更強的TCA 循環作用相關，因為重組菌株需要通過補充更多的能量來應激5乙酸的脅迫作用。乳酸是厭氧條件下葡萄糖代謝的副產物，圖3(c)為在不同時期發酵液中乳酸濃度，由該過表達菌株產生的乳酸在靜止期與對數期均多于對照菌株，間接說明其在該5 g·L-1脅迫條件下代謝葡萄糖的能力強于對照菌株。過表達GRX5的重組菌株胞外甘油明顯多于對照菌株，尤其是在對數期[圖3(d)]。甘油和海藻糖都是細胞內重要的保護性物質[19-20]，其含量的提高與過表達GRX5的菌株具有更強乙酸耐性相符合。

表2 過表達GRX5 對乙醇得率、生物量得率以及乙醇生成速率的影響Table 2 Impact of GRX5 overexpression on ethanol yield,biomass yield and ethanol volumetric production rate of Sc4126 in presence of 5 g·L-1 acetic acid

圖3 重組菌株與對照菌株在不同時期代謝物比較Fig.3 Extracellular metabolites of yeast strains in presence of 5 g·L-1 acetic acid in different growth phases

3 結 論

（1）過表達谷氧還蛋白基因GRX5能顯著提高釀酒酵母細胞對乙酸的耐受性。

（2）過表達GRX5能縮短工業釀酒酵母Sc4126在乙酸脅迫條件下的發酵周期，提高其乙醇產率，從而提高其發酵性能。

（3）過表達GRX5的菌株在乙酸脅迫條件下的發酵過程中產生了更多的脅迫保護性物質。

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