馬唐生防真菌ZC201301的篩選及其致病力測定

李健+李美+高興祥+房鋒

摘 要：從發(fā)病馬唐葉片上分離得到菌株ZC201301，對其培養(yǎng)特征和16S rDNA序列比對分析后，確認該菌株為厚垣孢鐮刀菌。盆栽試驗表明，該菌株分生孢子液對馬唐有很好的防治效果，鮮重防效達90.2%;對反枝莧、播娘蒿效果也較好，鮮重防效分別達到72.8%和50.7%;但對狗尾草和稗草防效較差，僅為27.9%和30.0%。進一步分析表明，菌株ZC201301對馬唐的致病力受接種孢子濃度、接種溫度等因素影響。作物安全性試驗表明，該菌株分生孢子液對小麥、大豆、玉米均相對安全。以上結(jié)果表明，菌株ZC201301有開發(fā)為生物除草劑的潛力。

關(guān)鍵詞：厚垣孢鐮刀菌;ZC201301;生物防治;馬唐;作物安全性

中圖分類號：S476.12 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0093-04

Isolation and Pathogenicity Detection of Biological

Control Fungi ZC201301 to Digitaria sanguinalis

Li Jian， Li Mei*， Gao Xingxiang， Fang Feng

（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）

Abstract Strain ZC201301 was isolated from diseased Digitaria sanguinalis leaves. According to its culture characters and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as Fusarium chlamydosporum. The pot experiment showed that the fresh weight control effects of conidium liquid on Digitaria sanguinalis， Amaranthus retroflexus， Descuminia Sophia were better， which were 90.2%， 72.8%， 50.7% respectively. The control effects on Setaria viridis and Echinochloa crusgalli were only 27.9% and 30.0%. The further analysis showed that the pathogenicity of strain ZC201301 to Digitaria sanguinalis was limited by spore concentration， inoculation temperature and other factors. The crop safety analysis showed that the strain ZC201301 was safe to Triticum aestivum， Glycine max， Zea mays. In summary， the ZC201301 might be a potential microbial herbicide.

Key words Fusarium chlamydosporum; Biological control; Digitaria sanguinalis; Crop safety

馬唐（Digitaria sanguinalis）是世界上公認的分布廣泛的18種惡性雜草之一[1]，主要危害小麥、大麥、玉米、水稻、高粱等禾本科作物，也是蔬菜田常見的主要雜草[2];馬唐環(huán)境適應能力強，生長迅速，消耗地力，目前主要依賴人工和化學防除[3];在中國，由馬唐引起的作物損失占秋熟旱作糧田雜草總損失的一半以上[4]。

近年來，化學除草劑的長期使用引起抗性雜草的產(chǎn)生和環(huán)境污染，同時伴隨人們環(huán)保意識逐漸增強，對農(nóng)藥殘留低的綠色食品的需求越來越高[5]。因此，研制生物除草劑進行目標雜草的防除，已成為生產(chǎn)上的迫切需求。我國生物除草劑研制時間較早，20世紀60年代中期研制并推廣的“魯保1號”菌劑對當時大豆菟絲子的防治起到了重要作用[5]。近年來，我國雜草研究機構(gòu)在馬唐-畫眉草彎孢[6]、稗草-新月彎孢[7]、闊葉雜草-出芽短梗霉[8]等菌草體系的研究中取得了進展，但目前我國生物除草劑登記產(chǎn)品仍然較少，而全世界已經(jīng)開發(fā)的生物除草劑產(chǎn)品已經(jīng)有20余種[9]。

微生物除草劑應具備對目標雜草強致病性和對作物安全兩大特點[10]。但是微生物除草劑在使用過程中又受到來自于環(huán)境條件的限制，往往只能在一定的環(huán)境范圍和區(qū)域內(nèi)發(fā)揮防治作用。本實驗室于2013年對山東省主要雜草病原真菌進行調(diào)查和分離，并從采自濟南的感病馬唐葉片上分離得到1株具有強致病力的菌株ZC201301（專利公開號：CN104250620A），對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定、生防效果和作物安全性評估，以期為其進一步深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：馬唐（Digitaria sanguinalis）、反枝莧（Amaranthus retroflexus）、播娘蒿（Descuminia sophia）、狗尾草（Setaria viridis）和稗草（Echinochloa crusgalli）等雜草種子均為本實驗室采集并保存。玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）和小麥（Triticum aestivum）種子均購自種子公司。endprint

試劑與培養(yǎng)基：次氯酸鈉、CTAB、氯仿·異戊醇、吐溫80等購自上海生物工程有限公司;Taq酶等PCR相關(guān)試劑購自日本Takara 公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar， PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、水1 000 mL。

1.2 病原菌的分離純化

從山東省濟南市采集感病的馬唐葉片，放于信封內(nèi)，直接用于病原菌分離或4℃保存。剪下病葉的病健結(jié)合部位，無菌水沖洗2次， 2%（V/V）次氯酸鈉溶液表面消毒6 min，70%（V/V）乙醇表面消毒1 min，無菌水漂洗3次后將這些葉片組織轉(zhuǎn)移到空的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，以上步驟均在超凈工作臺內(nèi)完成。待葉片組織吹干后置于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出菌落，挑取部分菌絲至新的PDA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至產(chǎn)孢，經(jīng)過單孢子分離得到菌株，并編號。

1.3 菌株的鑒定

將菌株ZC201301在PDA平板上培養(yǎng)10 d，觀察其菌落形態(tài)。同時洗下分生孢子，顯微鏡下觀察，按照真菌鑒定手冊進行初步鑒定[11]。CTAB法[12]提取菌株的基因組DNA，用引物ITS4 （5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5 （5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）進行PCR擴增。PCR 反應條件為：94℃預變性4 min;94℃變性 1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共29個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物回收測序。利用NCBI Blast對所測序列進行比對分析，利用Clustal X 2.0和Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 ZC201301菌株致病力影響因素測定

25℃、光照/黑暗12 h/d交替條件下，ZC201301菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，收集孢子并配制成濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液（含0.1%吐溫80）。

將濃度為1×108個/mL和1×105個/mL的孢子懸浮液用手持小噴壺分別噴施于2～3、4～5葉期的馬唐植株上，黑暗條件下放于不同溫度和濕度人工氣候箱內(nèi)48 h，之后持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，14 d后記錄致死株數(shù)和稱量植株鮮重，計算鮮重防效，以噴施0.1%吐溫80的植株為對照，每處理重復3次。

1.5 寄主范圍測定

收集并配制濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液噴施于2～3葉期反枝莧、播娘蒿、狗尾草、稗草（以上雜草種子均采自山東省濟南市）等雜草上;25℃、黑暗保濕培養(yǎng)48 h，之后持續(xù)光照培養(yǎng)。接種14 d后記錄發(fā)病程度和鮮重防效，以噴施0.1%吐溫80的植株為對照，每處理重復3次。

1.6 ZC201301作物安全性測定

培養(yǎng)ZC201301菌株并收集分生孢子，將濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液噴施于3～4葉期的小麥、大豆、玉米植株上，培養(yǎng)方法同1.5。接種14 d后記錄發(fā)病程度和鮮重防效。參考李永龍文獻[8]，按以下標準記載發(fā)病程度：NS 表示無癥狀（一直無病斑，植株正常生長）;LS 表示有輕微反應（初期葉片分布零星斑點，14 d后鮮重不受抑制）;MS 表示中等感病（葉面出現(xiàn)較多病斑，14 d后鮮重受到抑制）;SS 表示嚴重感病（葉片病斑連成一體，14 d后鮮重受到嚴重抑制）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

ZC201301菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，菌落質(zhì)地緊密，邊緣規(guī)則，呈厚絮狀，生長初期呈白色，逐漸產(chǎn)生粉紅色色素。培養(yǎng)過程中產(chǎn)生兩種孢子，一種為鐮刀形大孢子，一種為類橢圓形厚垣孢子。提取基因組DNA，克隆16S rDNA基因序列，回收測序后進行序列分析。表型觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1 ）分析表明，ZC201301菌株為厚垣孢鐮刀菌（Fusarium chlamydosporum）。

圖1 ZC201301進化樹分析

2.2 保濕時間和接種濃度對致病力的影響

由表1可以看出，濕度對菌株ZC201301影響較大，噴接相同濃度孢子液，90%濕度下馬唐受抑制率明顯高于40%濕度條件下。而在相同濕度條件下，噴施不同濃度孢子液的馬唐受抑制率存在一定差別，但是差異不顯著（P<0.05）。

表1 濕度和接種濃度對菌株ZC201301

致病力的影響

濕度

（%）

1×105個/mL

致死率（%） 鮮重防效（%）

1×108個/mL

致死率（%） 鮮重防效（%）

90 30.1±11.1b 86.7±4.1a 45.2±5.2b 90.2±1.4a

40 15.2±6.2b 41.6±6.8a 17.8±2.8b 51.5±0.7a

注：表中數(shù)值為平均值±標準誤（n=3），同行數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05 水平上差異顯著。

2.3 接種溫度和接種時期對致病力的影響

由表2可以看出，菌株ZC201301對馬唐的致病力受接種時期和溫度影響較大。相對于22℃的接種條件，30℃下菌株ZC201301對相應葉期的馬唐防效均顯著下降。而在相同接種溫度下，菌株ZC201301對2～3葉期馬唐的防效要遠好于4～5葉期馬唐。

表2 接種溫度和時期對菌株ZC201301

致病力的影響

溫度

（℃）

2～3葉期

致死率（%） 鮮重防效（%）

4～5葉期

致死率（%） 鮮重防效（%）endprint

22 43.2±3.2a 88.6±2.9a 18.7±2.3a 68.4±5.7a

30 28.5±5.1b 80.2±2.1b 3.6±3.3b 27.9±4.8b

注：表中數(shù)值為平均值±標準誤（n=3），同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著。下同。

2.4 菌株ZC201301對不同雜草致病力分析

菌株ZC201301孢子液噴施2～14 d后對反枝莧、播娘蒿、狗尾草、稗草的平均鮮重防效分別達到72.8%、50.7%、27.9%、30.0%，對反枝莧防效最好，播娘蒿次之，二者之間差異顯著，均顯著優(yōu)于狗尾草和稗草（表3）。

表3 ?菌株ZC201301對不同雜草的生物防效

雜草種類

致死率（%）

鮮重防效（%）

反枝莧Amaranthus retroflexus 49.6±3.4 72.8±1.3a

播娘蒿Descuminia sophia 0 50.7±2.6b

狗尾草Setaira viridis 10.7±5.0 27.9±2.7c

稗草 Echinochloa crusgalli 0 30.0±5.3c

2.5 作物安全性分析

試驗結(jié)果（表4）表明，菌株ZC201301孢子液對供試作物相對安全，大豆（中黃57、魯豆10）和小麥（濟麥22、山農(nóng)15號）無致病性（NS），玉米（魯單981、登海6702）表現(xiàn)為輕微反應（LS），接種初期葉片可見少量黑點，14 d后病斑未增多或擴展，鮮重未受到抑制。

表4 作物安全性試驗

作物種類

株高抑制率（%）

感病程度

大豆

中黃57 0 NS

魯豆10 0 NS

小麥

濟麥22 0 NS

山農(nóng)15號 0 NS

玉米

魯單981 3.5±2.2 LS

登海6702 4.3±1.9 LS

3 討論與結(jié)論

隨著人們生態(tài)意識的增強，微生物除草劑逐漸成為當前除草劑研制和開發(fā)的熱點[13]。本試驗菌株ZC201301是從當?shù)仡静●R唐植株上采得，未經(jīng)任何基因修飾，環(huán)境適應性強，使用時不會造成生態(tài)環(huán)境的隱患。經(jīng)培養(yǎng)觀察和分子生物學鑒定，將該菌株歸為厚垣孢鐮刀菌。該菌在PDA培養(yǎng)基上易于培養(yǎng)，產(chǎn)生緊密、呈厚絮狀菌落。該菌株生長溫度范圍廣，生長速度快，產(chǎn)孢量高，具備開發(fā)為雜草生防菌的基礎條件。

不同于化學除草劑，真菌除草劑對環(huán)境條件的要求較為苛刻[14]。室內(nèi)生測試驗表明，菌株ZC201301對馬唐的致病力受到濕度的影響，在接菌后濕度為90%條件下，其對馬唐的鮮重防效達到90.2%;而在濕度為40%條件下僅為51.5%;相對于濕度對菌株ZC201301致病力的影響，接種孢子液濃度對其致病力影響較小。這表明菌株ZC201301孢子致病力較強，僅需在較低的濃度下就能達到防治效果，但是其致病力的發(fā)揮需要較高的濕度條件，受到一定環(huán)境因素的限制。進一步的研究顯示，菌株ZC201301對接種溫度有較高要求，相對于30℃條件，22℃接種條件下生防效果更佳;相同接種溫度下，對2～3葉期馬唐防效明顯好于4～5葉期。這可能是由于高溫條件下馬唐生長較快，而菌種產(chǎn)生致病效果需要一定時間，這在一定程度上限制了菌株生防效果的發(fā)揮。同時作物安全性試驗表明該菌株對小麥（濟麥22）、大豆（中黃57）和玉米（魯單981）安全，表明該菌有望作為生物除草劑候選菌。

參 考 文 獻：

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