花生果針離體培養(yǎng)研究

李長(zhǎng)生+夏晗+趙傳志+侯蕾+張燁+趙術(shù)珍

摘 要：以中華8號(hào)花生品種為試材，研究了GA、6-BA和生長(zhǎng)素（IAA和NAA）對(duì)花生果針離體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，花生果針離體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為MS 培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分、B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分、300 mg/L水解酪蛋白、6%蔗糖、1.0 mg/L GA、0.5 mg/L IAA和0.01 mg/L 6-BA，在此條件下，花生子房膨大率為72%。

關(guān)鍵詞：花生;果針;子房;離體培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S565.201 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2015）06-0008-04

Study on Peg Culture in Vitro of Peanut

Li Changsheng， Xia Han， Zhao Chuanzhi， Hou Lei， Zhang Ye， Zhao Shuzhen*

（Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong

Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China）

Abstract Using Zhonghua 8 as experimental material， the effects of GA， 6-BA and auxin （IAA and NAA） on peg culture in vitro of peanut were studied. The results indicated that the optimum medium contained inorganic salts of MS， organic constituents of B5， 300 mg/ L casein hydrolysate and 6% sucrose and supplemented with 1.0 mg/L GA， 0.5 mg/L IAA and 0.01 mg/L 6-BA. Under this condition， the peanut ovary ?enlargement rate was 72%.

Key words Peanut; Peg; Culture in vitro

花生是我國(guó)最重要的油料作物之一。我國(guó)花生總產(chǎn)量占全國(guó)油料作物總產(chǎn)量的1/2，占世界花生總產(chǎn)量的2/5，居世界第一位，實(shí)現(xiàn)花生產(chǎn)業(yè)全面、協(xié)調(diào)、可持續(xù)發(fā)展對(duì)保障我國(guó)糧油安全具有重要意義[1]。花生遺傳多樣性低[2]，利用生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種培育，是實(shí)現(xiàn)我國(guó)花生遺傳改良新飛躍的關(guān)鍵。然而，花生的分子生物學(xué)研究遠(yuǎn)落后于其它農(nóng)作物，對(duì)花生重要農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)理研究甚少。因此，加快花生分子生物學(xué)研究進(jìn)程，揭示花生產(chǎn)量、品質(zhì)形成的分子機(jī)理，對(duì)利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段結(jié)合傳統(tǒng)育種方式培育花生高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病品種具有重要意義。

花生與大豆、油菜、擬南芥有很大不同，花生植株在地上部分開花，授粉后合子只分裂幾次便停止，子房在受精后的一段時(shí)間內(nèi)并未明顯膨大，子房柄卻不斷伸長(zhǎng)。伸長(zhǎng)的子房柄和未膨大的受精子房形成一針狀結(jié)構(gòu)，稱為“果針”。在正常生長(zhǎng)的花生植株上，隨著果針的伸長(zhǎng)，受精子房被推入土壤中，在黑暗條件下開始膨大，最終發(fā)育成莢果[3～6]。如果人為阻止果針入土，在光照條件下果針將不能膨大形成莢果[4，7，8]。黑暗和機(jī)械刺激曾被認(rèn)為是果針入土后導(dǎo)致莢果膨大的主要原因[9]，但其誘導(dǎo)莢果發(fā)育的分子機(jī)理尚不清楚。在模式植物擬南芥中的研究表明，激素信號(hào)是外界環(huán)境調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的橋梁。由于在大田栽培條件下對(duì)果針處理受環(huán)境影響較大，為獲得均一的試驗(yàn)材料以研究黑暗和機(jī)械刺激誘導(dǎo)基因表達(dá)變化、激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)等的變化，建立和優(yōu)化果針離體培養(yǎng)體系尤為重要，其優(yōu)勢(shì)在于不受季節(jié)限制，能夠精確控制處理強(qiáng)度、時(shí)間等各種因素，可為花生莢果膨大機(jī)理的研究提供穩(wěn)定可靠的試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)品種 供試花生品種為中華8號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分、B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分、300 mg/L水解酪蛋白和6%蔗糖。配方如下：

① GA濃度對(duì)子房膨大的影響

A： 基本培養(yǎng)基+0.05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA

B： 基本培養(yǎng)基+0.05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L GA

C： 基本培養(yǎng)基+0.05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L GA

D： 基本培養(yǎng)基+0.05mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+2.0 mg/L GA

② 6-BA濃度對(duì)子房膨大的影響

E： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+1.0 mg/L NAA+0.01 mg/L 6-BA

B： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+1.0 mg/L NAA+0.05 mg/L 6-BA

F： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA

③ IAA濃度對(duì)子房膨大的影響

G： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+0.05 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAAendprint

H： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+0.05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA

I： 基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+0.05 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IAA

④NAA濃度對(duì)子房膨大的影響

使用培養(yǎng)基B和H的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行比較。

1.2 試驗(yàn)方法

選取飽滿的花生種子于2014年5月初播種于大田。開花后取第二、三節(jié)位長(zhǎng)3 cm且粗細(xì)一致的花生果針，用自來(lái)水沖洗干凈，70%酒精表面消毒5 s，再用0.1%升汞表面消毒8 min，無(wú)菌水沖洗3次，然后切取果針頂端1 cm左右（帶子房和部分子房柄），子房朝上垂直接種于培養(yǎng)基上。接種后置于完全黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25±1℃， 相對(duì)濕度40%～60%。每處理10瓶，每瓶培養(yǎng)基中放5個(gè)果針。

子房膨大率（%）=每瓶培養(yǎng)基中膨大的果針數(shù)/接種果針總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 GA濃度對(duì)子房膨大的影響

由圖1可以看出，在6-BA （0.05 mg/L）和NAA（1.0 mg/L ）濃度不變的條件下，花生子房膨大率隨GA濃度的升高先增大后減小，當(dāng)GA濃度為1.0 mg/L時(shí)，子房膨大率達(dá)最大，為51.1%。表明適宜濃度的GA可以促進(jìn)子房的膨大，但GA濃度過(guò)高則會(huì)抑制子房的膨大。

注：A：0.1 mg/L GA;B：0.5 mg/L GA;

C：1.0 mg/L GA;D：2.0mg/L GA。

圖1 赤霉素GA對(duì)子房膨大的影響

2.2 6-BA濃度對(duì)子房膨大的影響

由圖2可知，隨著6-BA濃度的增加，花生子房膨大率逐漸降低。當(dāng)6-BA濃度為0.01 mg/L時(shí)，膨大率為72%，而當(dāng)6-BA濃度達(dá)到0.10 mg/L后，子房膨大率僅為29.2%。

注：E：0.01 mg/L 6-BA;B：0.05 mg/L 6-BA;F：0.1 mg/L 6-BA。

圖2 6-BA對(duì)子房膨大的影響

2.3 IAA和NAA濃度對(duì)子房膨大的影響

由圖3可知，當(dāng)NAA與IAA濃度均為1.0

圖3 IAA和NAA濃度對(duì)子房膨大的影響

mg/L時(shí)，NAA處理的花生子房膨大率高于IAA。由于IAA是植物體內(nèi)存在的激素，適當(dāng)降低IAA濃度至0.5 mg/L，效果優(yōu)于1.0 mg/L的NAA，子房膨大率可達(dá)53.3%。

3 結(jié)論與討論

激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，花生胚胎發(fā)育狀況與內(nèi)源激素的代謝密切相關(guān)[10]。許多研究表明，花生子房膨大受到內(nèi)源植物激素的調(diào)節(jié)[7～9，11]，但哪種激素起主要作用仍存在爭(zhēng)議。封海勝等認(rèn)為GA在子房膨大過(guò)程中起主要作用[12];而馮啟理和潘瑞熾[13]認(rèn)為NAA 是誘導(dǎo)子房膨大的主要激素，GA 是促進(jìn)子房柄伸長(zhǎng)的主要激素，花生果針能否從伸長(zhǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入膨大生長(zhǎng)，與這兩種激素的平衡狀況有關(guān)[13]。而從豌豆和西紅柿果實(shí)發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素和GA是協(xié)同起作用的[14，15]。正常情況下擬南芥莢果發(fā)育需要受精作用的完成，受精誘導(dǎo)種子中生長(zhǎng)素的合成，而生長(zhǎng)素激活了胚珠中GA代謝，GA促進(jìn)莢果正常發(fā)育[16，17]。Feng等[18]報(bào)道0.5 mg/L或2.0 mg/L NAA有利于莢果形成和胚胎發(fā)育;而隨后，F(xiàn)eng等[19]研究又表明2.0 mg/L NAA不利于莢果和胚胎發(fā)育，并推測(cè)這種試驗(yàn)結(jié)果的矛盾可能是兩次試驗(yàn)中培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分及環(huán)境條件不同改變了植物材料對(duì)激素的需求和響應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，合適的GA濃度有利于子房膨大;生長(zhǎng)素是子房膨大不可缺少的，而且較低濃度的IAA比NAA效果更好;較高濃度的6-BA并不利于子房膨大。

Feng等[19]在培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L NAA 和0.5 mg/L GA時(shí)子房膨大率達(dá)到81%，但筆者利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)離體果針時(shí)子房膨大率均未超過(guò)60%，而在培養(yǎng)基中添加0.01 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA 和0.5 mg/L GA時(shí)子房膨大率達(dá)72%。綜合各種激素濃度的影響，本試驗(yàn)所得花生果針最佳離體培養(yǎng)基為在MS 培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分、B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分、300 mg/L水解酪蛋白和6%蔗糖基礎(chǔ)上添加1.0 mg/L GA、0.5 mg/L IAA和0.01 mg/L 6-BA。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 湯松，禹山林，廖伯壽，等. 我國(guó)花生產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在問(wèn)題及發(fā)展對(duì)策[J].花生學(xué)報(bào)，2010，39（3）：35-38.

[2] Pandey M K，Monyo E，Ozias-Akins P，et al. Advances in Arachis genomics for peanut improvement[J]. Biotechnol. Adv.，2012，30（3）：639-651.

[3] Zharare G E，Blamey F P，Asher C J. Initiation and morphogenesis of groundnut （Arachis hypogaea L.） pods in solution culture[J]. Ann. Bot.，1998，81：391-396.

[4] Moctezuma E. The peanut gynophore： a developmental and physiological perspective[J]. Can. J. Bot.，2003，81：183-190.endprint

[5] Xia H，Zhao C Z，Hou L，et al. Transcriptome profiling of peanut gynophores revealed global reprogramming of gene expression during early pod development in darkness[J]. BMC Genomics，2013，14：517.

[6] Zhu W，Chen X，Li H，et al. Comparative transcriptome analysis of aerial and subterranean pods development provides insights into seed abortion in peanut [J]. Plant Mol. Biol.，2014，85（4-5）：395-409.

[7] Zamski E，Ziv M. Pod formation and its geotropic orientation in peanut， Arachis hypogaea L.，in relation to light and mechanical stimulus[J]. Ann. Bot.，1975，40：631-636.

[8] Thompson L K，Ziv M，Deitzer G F. Photocontrol of peanut （Arachis hypogaea L.） embryo and ovule development in vitro [J]. Plant Physiol.，1985，78：370-373.

[9] 潘瑞熾，陳惜吟，羅蘊(yùn)秀.花生入地結(jié)莢原因的研究[J].植物生理學(xué)報(bào)，1983，9：109-116.

[10]張新友，徐靜， 湯豐收，等.花生種間雜種胚胎發(fā)育及內(nèi)源激素變化[J]. 作物學(xué)報(bào)，2013，39（6）：1127-1133.

[11]Lee T A，Ketring D L，Powell R D. Flowering and growth response of peanut plants （Arachis hypogaea L. var. Starr） at two levels of relative humidity[J]. Plant Physiol.，1972，49（2）：190-193.

[12]封海勝，申馥玉，顧淑媛，等. 花生子房離體培養(yǎng)研究簡(jiǎn)報(bào)[J].中國(guó)油料，1980（2）：69-72.

[13]馮啟理，潘瑞熾. NAA，GA3和BA 對(duì)離體花生子房結(jié)莢的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，1989，15（2）：111-116.

[14]Ozga J A， Reinecke D M. Interaction of 4-chloroindole-3-acetic acid and gibberellins in early pea fruit development [J]. Plant Growth Regul.，1999，27：33-38.

[15]Serrani J C，Ruiz-Rivero O，F(xiàn)os M，et al. Auxin-induced fruit set in tomato is mediated in part by gibberellins[J]. Plant J.，2008，56：922-934.

[16]Vivian-Smith A，Luo M，Chaudhury A，et al. Fruit development is actively restricted in the absence of fertilization in Arabidopsis[J]. Development，2001，128：2321-2331.

[17]Dorcey E，Urbez C，Blazquez，et al. Fertilization dependent auxin response in ovules triggers fruit development through the modulation of gibberellin metabolism in Arabidopsis[J]. Plant J.，2009，58（2）：318-332.

[18]Feng Q L，Stalker H T，Pattee H E，et al. Arachis hypogaea plant regeneration through in citro culture of peg tips[J]. Peanut Sci.，1995，22：129-135.

[19]Feng Q L，Pattee H E，Stalker H T. In vitro reproductive development of peanut，Arachis hypogaea L.，as influenced by plant growth regulators， sucrose and pH[J].Peanut Sci.，1995，22（2）：135-141.endprint