外源乙烯對桃果實采后貯藏過程中線粒體內細胞色素氧化酶的影響

闞 娟，張慶慶，萬 冰，劉 俊，金昌海（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州　225127）

外源乙烯對桃果實采后貯藏過程中線粒體內細胞色素氧化酶的影響

闞 娟，張慶慶，萬 冰，劉 俊，金昌海*
（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州225127）

以硬溶質型桃果實‘加納巖’為試材，研究外源乙烯處理對桃果實采后貯藏過程中呼吸速率、乙烯釋放量、細胞色素氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）活性以及線粒體編碼的COX 3 種亞基（COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）基因表達量的影響。結果表明：外源乙烯處理加速了硬溶質型桃果實‘加納巖’在采后貯藏過程中硬度的下降，促進了呼吸作用和內源乙烯釋放，使呼吸高峰和乙烯釋放高峰提前出現。同時外源乙烯抑制了COX酶活性，抑制了貯藏后期COXⅠ和COXⅡ亞基基因的表達，抑制了整個貯藏過程中COXⅢ亞基基因的表達。外源乙烯處理抑制了COX途徑的呼吸，加速了果實的軟化衰老。

桃；乙烯；線粒體；呼吸速率；細胞色素氧化酶

線粒體是植物細胞的主要細胞器，是細胞能量代謝和物質轉換的中樞。線粒體除了能量轉換作用，還參與了4 種呼吸酶復合物的形成，包括NADH-CoQ還原酶、泛醌-細胞色素C還原酶、細胞色素氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）和ATP合成酶［1］。其中COX存在于線粒體內膜上，是線粒體呼吸酶的標志酶，也是線粒體呼吸鏈上氧化磷酸化過程中的關鍵酶，把呼吸底物的電子經過細胞色素系統直接傳遞給分子態氧，是線粒體呼吸控制的主要部位［2］。COX有13 個亞基，為一多亞基、多形式、多基因組來源的酶蛋白復合體，其中最大的3 個亞基（COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）由線粒體DNA（mtDNA）編碼，是酶活性不可缺少的部分。目前有研究人員從活性氧代謝的角度，通過蛋白質組學、蛋白免疫雜交以及其他生理生化分析，證明了線粒體蛋白氧化損傷與果實成熟衰老的關系［3］。一系列實驗表明，細胞衰老時線粒體功能會發生退行性改變［4］。COX是呼吸鏈末端酶，其活性大小可直接影響線粒體功能，反映出生物體的有氧呼吸代謝水平。乙烯是5 大類植物激素之一，參與了植物從種子萌發到成熟以及衰老的一系列生命過程的調節及逆境條件下植物的脅迫反應。有研究證明外源乙烯是通過乙烯的自我催化而誘導內源乙烯生成的，乙烯的生理作用可能是通過調節植物體內活性氧水平來實現［5］。在對綠豆黃化幼苗研究中發現外源乙烯能顯著提高活性氧產生速率，同時使得線粒體呼吸高峰提前出現，從側面表明乙烯對線粒體呼吸的促進作用可能是通過提高線粒體活性氧的產生速率實現的［6］。當細胞色素氧化酶途徑受阻時，抗氰呼吸產生或加強，而乙烯與抗氰呼吸上升有平行的關系，乙烯刺激抗氰呼吸，誘發呼吸躍變產生［7］。

目前外源乙烯對果實線粒體內呼吸作用、COX活性及基因表達影響的研究還鮮見報道。本實驗以外源乙烯處理的硬溶質型‘加納巖’桃果實為試材，通過對外源乙烯處理后果實在貯藏過程中線粒體內呼吸作用、乙烯釋放、COX活性以及COX 3 種亞基的表達的研究，了解桃果實在貯藏過程中外源乙烯對其呼吸作用及線粒體中關鍵酶COX的影響，從而為乙烯與COX在桃果實采后軟化衰老中作用研究提供一定的實驗依據。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

供試品種為硬溶質型‘加納巖’桃果實，盛花后95 d，桃果實褪綠，基本全紅，頂部暗紅，果實較硬。

焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、LiCl、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、亞精胺、3-［3-（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內鹽（3-［（3-cholamidopropyl）dimethyl-amino］-1-propanesulfonate，CHAPS）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、還原型細胞色素C生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、TaKaRa TaqTMDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker寶生物工程（大連）有限公司；NaCl、HCl、氯仿、異戊醇、蔗糖、氯化鎂均為分析純。

1.2儀器與設備

GY-1型果實硬度計牡丹江市機械研究所；5804R高速冷凍離心機、5341梯度聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Eppendorf公司；7300熒光定量儀美國ABI公司；GC-14B氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1材料處理

一部分材料以 7～8 個為單位，裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，20 ℃（95%以上的相對濕度）貯藏。實驗處理包括：1）對照，在20 ℃條件下密閉處理12 h；2）20 ℃條件下用50 μL/L外源乙烯密閉處理12 h。處理后的果實于20 ℃條件下貯藏 0、2、4、6、8、10 d 后，取部分鮮果測定硬度、呼吸速率及乙烯釋放量后再取果肉部分切成小塊，用液氮處理后裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，并保存在－75 ℃超低溫冰箱中用于分析實驗。實驗3 次重復。1.3.2果實硬度的測定

采用GY-1型果實硬度計（調頭直徑3.5 mm），測定鮮果去除果皮后果肉的硬度。每個果實胴部不同部位對稱均勻選取6 個點，每次測量6 個果實，均勻取平均值。1.3.3呼吸速率的測定

采用靜置法［8］。

1.3.4乙烯釋放量的測定

參照Jin Changhai等［9］的方法。氣相色譜條件為：氫焰離子化檢測器，SPB-1毛細管柱（0.25 mm×30 m）。采用GC-14B氣相色譜儀，載氣為N2，柱溫40 ℃，檢測器溫度120 ℃，實驗重復3 次。

1.3.5線粒體的提取

參照Bonner［10］、Liang Wusheng［11］等方法。

1.3.6COX活性的測定

取上述提取的線粒體制備液1 mL，COX活性的測定參照Errede等［12］的方法。

1.3.7桃果實總RNA提取

參照Meisel等［13］方法提取。

1.3.8COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ基因的熒光定量PCR （real-time PCR）

根據NCBI上COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ基因序列信息（GenBank登錄號分別為M16884.1，Z 1 1 9 8 0.1，X 1 5 1 3 1.1），用P r i m e r p r e m i e r 5.0 軟件設計引物熒光定量P C R引物C O XⅠ（5'-G A C A C C C G A G C C T A C T T T A C-3'）和（5'-GCTATGATGGCGAATACTGC-3'），COXⅡ（5'-GCTTACAAGACGCCACATCACC-3'）和（5'-CGTAGGGAGGGAAGGGCAAT-3'），COXⅢ（5'-CAGCCTAGTTCCTACCCACGAC-3'）和（5'-CCCGTTGCTATGAAGAATGTTG-3'）用于擴增目的基因。Actin（5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'）和（5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'）用于內參基因。

1.4數據分析

所有數據用SPSS軟件進行統計分析。

2　　結果與分析

圖 1　　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中硬度的影響Fig.1　　Effect of exogenous ethylene on peach hardness during postharvest storage

2.1外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中硬度變化的影響如圖1所示，經外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實在貯藏的6 d內硬度有明顯的下降，之后硬度下降趨于平緩。桃果實貯藏到第10天時，對照組‘加納巖’桃果實與外源乙烯處理組的桃果實硬度相近。外源乙烯處理明顯加快了‘加納巖’桃果實硬度下降，但對果實的最終軟化程度影響不明顯。

2.2外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中呼吸速率的影響

圖 2　　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中呼吸速率的影響Fig.2　　Effect of exogenous ethylene on mitochondrial respiration rate of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖2所示，經外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實在貯藏前期呼吸速率迅速升高，在貯藏到第6天時達最大值后有所下降。而對照組的呼吸速率在整個貯藏過程中一直增加。在整個貯藏過程中兩者呼吸速率都存在顯著性差異。外源乙烯加快了‘加納巖’桃果實呼吸高峰的到來。2.3外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中乙烯釋放量的影響

圖 3　　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中乙烯釋放量的影響Fig.3　　Effect of exogenous ethylene on ethylene production of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖3所示，經外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實在貯藏過程中乙烯釋放量要明顯高于對照組。且在貯藏到第8天時，外源乙烯處理的桃果實乙烯釋放量達到峰值，之后乙烯釋放量下降。外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實和對照組在同貯藏時期乙烯釋放量存在極顯著差異（P＜0.01）。外源乙烯誘導了硬溶質型桃果實中內源乙烯的釋放。

2.4外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中線粒體內COX活性的影響

圖 4　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中線粒體內COX活性的影響Fig.4　Effect of exogenous ethylene on mitochondrial COX activity of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖4所示，經外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實在貯藏過程中COX活性整體比對照組低，桃果實COX活性在貯藏前4 d不斷升高，之后不斷下降。兩者在同一貯藏時期COX活性都存在顯著性差異（P＜0.05）。外源乙烯處理抑制了桃果實采后貯藏過程中COX活性，但對COX

活性變化趨勢無顯著影響。

2.5外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中

COXⅠ亞基基因表達水平的影響

圖 5　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中CCOOXXI基因表達的影響Fig.5　Effect of exogenous ethylene on the expression of CCOOXXI in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖5所示，對照和外源乙烯處理組桃果實貯藏過程中COXⅠ均有表達，且變化趨勢相似，COXⅠ的相對表達量在貯藏前4 d相近。說明外源乙烯處理硬溶質型桃果實‘加納巖’桃果實后，對于其在貯藏前期COXⅠ基因表達無顯著影響。但到貯藏后期（6～10 d）外源乙烯處理顯著抑制了COXⅠ基因表達（P＜0.05）。

圖 6　　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中COXCOXⅡ基因表達的影響Fig.6　　Effect of exogenous ethylene on the expression of COXCOXⅡ in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

2.6外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中COXⅡ亞基基因表達水平的影響如圖6所示，硬溶質型桃果實‘加納巖’桃果實采后貯藏時COXⅡ基因相對表達量在貯藏前期（0～4 d）都明顯低于外源乙烯處理組，而到貯藏后期（6～10 d）外源乙烯處理的COXⅡ基因相對表達量比對照組低，外源乙烯抑制了‘加納巖’桃果實貯藏后期COXⅡ基因的相對表達量。外源乙烯處理組與對照組在貯藏過程中COXⅡ基因相對表達量變化趨勢一致，都是隨著貯藏時間的延長先增加后減小。

2.7外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中COXⅢ亞基基因表達水平的影響

圖 7　外源乙烯處理對‘加納巖’桃果實采后貯藏過程中CCOOXXⅢ基因表達的影響Fig.7　Effect of exogenous ethylene on the expression of CCOOXXⅢ in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖7所示，外源乙烯抑制了硬溶質桃果實貯藏過程中COXⅢ基因的表達。對照組COXⅢ基因相對表達量隨貯藏時間的延長先增加后減小，而外源乙烯處理組COXⅢ在貯藏到第2天時，其基因相對表達量達到最大，之后快速下降，到第6天時趨于平緩。

3　　討 論

有研究［14-15］認為乙烯對果實采后貯藏過程中成熟衰老起著重要的調節作用，影響著機體的酶活性、激素水平和呼吸速率等。經外源乙烯處理的硬溶質型桃果實‘加納巖’在貯藏過程中軟化進程加快，但貯藏到后期桃果實仍然和對照組有相近的硬度（圖1），對果實最終的軟化程度無明顯影響。

在果蔬中，線粒體電子傳遞鏈主要有細胞色素主路和抗氰交替支路兩條途徑［16］，其中抗氰呼吸途徑是以交替氧化酶為末端氧化酶的氰不敏感電子傳遞鏈途徑，從線粒體內膜電子傳遞鏈的主呼吸途徑的泛醌處分支，電子不進行跨膜運輸直接傳遞到末端氧化酶，并催化分子氧還原成水，不產生質子電化學勢能，不能驅動ATP的合成，只能產生少量的能量［17］。在果實呼吸躍變時，以抗氰呼吸為主，呼吸躍變后主要以細胞色素途徑為主，果實采后貯藏過程中的成熟衰老時伴隨著總呼吸的加強［18］。已有研究［19］證明，乙烯處理可以誘導多種植物組織抗氰呼吸能力的發生。本研究中經外源乙烯處理的桃果實在貯藏前期呼吸速率與對照組呈現迅速上升的趨勢，到貯藏的中后期經外源乙烯處理的桃果實呼吸作用又迅速下降，而對照組呼吸速率在貯藏過程中一直呈現上升趨勢，且在貯藏后期呼吸速率高于乙烯處理組，乙烯處理顯著促進了‘加納巖’貯藏前期和中期的呼吸速率，使呼吸高峰提前出現（圖2）。在貯藏過程中外源乙烯處理的桃果實乙烯釋放速率顯著高于貯藏同時期的對照組（圖3），外源乙烯處理顯著誘導了‘加納巖’桃果實采后貯藏中內源乙烯的釋放。

COX在線粒體呼吸鏈電子傳遞中發揮著極其重要的作用［20-21］。其中COXⅠ、COXⅡ及COXⅢ 3 種亞基基因共同構成了COX的核心結構，共同影響著COX的活性，而COX活性直接影響到線粒體功能狀態，一旦線粒體功能受損，就會促使呼吸鏈產生大量的活性氧，導致機體受損［22］。本研究中，在桃果實采后貯藏過程中，經外源乙烯處理的硬溶質型桃果實‘加納巖’COX活性要比對照組低（圖4）。外源乙烯抑制了COX活性，抑制了細胞色素氧化酶途徑的呼吸。植物中雖然存在多條電子傳遞途徑，但是 細胞色素氧化酶途徑和抗氰呼吸途徑為兩條主要途徑，植物對這兩條途徑有協調控制現象，即當細胞色素氧化酶途徑受阻時，抗氰呼吸產生或加強，乙烯生成增加，加速了果實的成熟衰老。本研究中外源乙烯可能通過抑制桃果實在貯藏過程中COX活性，從而使果實呼吸代謝從細胞色素途徑轉向抗氰呼吸途徑，最終促進果實衰老。

COX的蛋白表達受mtDNA和COX亞基基因的影響，COX最大的3 個亞基（COXⅠ、COXⅡ及COXⅢ）是酶活性不可缺少的部分［23-24］，因此研究COX基因表達可以為從分子水平上探明COX對果實成熟軟化的作用提供理論依據。有研究證明，COX的表達量大小會關系到COX活性的大小［25］，而COX活性一旦受到影響，就會直接影響線粒體功能狀態，從而影響果實線粒體的呼吸代謝作用，導致活性氧的積累、果實的衰老等。本研究中，COXⅠ和COXⅡ兩種亞基基因相對表達量在桃果實貯藏前期（0～4 d）經外源乙烯處理的要比對照組高，而在貯藏后低于對照組（圖5和圖6）。可見，果實在采后貯藏過程中，外源乙烯在貯藏后期抑制COXⅠ和COXⅡ這兩個亞基的表達，與貯藏后期COX活性不斷下降密切相關（圖4）。經外源乙烯處理的COXⅢ基因在果實采后貯藏各個時期都要比對照組低（圖7），與外源乙烯處理后COX活性變化趨勢相似，這可能與COXⅢ基因對COX活性調控起重要作用存在一定關系。

4　　結 論

研究了外源乙烯對硬溶質型桃果實貯藏過程中線粒體呼吸作用及呼吸代謝關鍵酶COX的影響。研究表明：外源乙烯能使桃果實更快軟化，但不能改變果實最終的硬度；外源乙烯促進了呼吸速率和乙烯釋放，使得桃果實的呼吸高峰和乙烯釋放高峰提前到來，加速了桃果實貯藏過程中的成熟衰老。外源乙烯抑制了COX活性，對線粒體編碼的COX 3 種亞基表達都有一定程度的影響，抑制了COX途徑的呼吸，增加了抗氰呼吸，加速了果實的軟化衰老。

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Effect of Exogenous Ethylene on Mitochondrial Cytochrome C Oxidase during Postharvest Storage of Peach Fruit

KAN Juan， ZHANG Qingqing， WAN Bing， LIU Jun， JIN Changhai*
（College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou225127， China）

The effect of exogenous ethylene on respiration rate， ethylene production， cytochrome C oxidase （COX） activity and the gene expression levels of mitochondrial DNA-encoded subunits Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ of cytochrome C oxidase in fruits of the stony-hard peach （Prumus persica） cultivar ‘Jianayan' was determined during postharvest storage. The results showed that exogenous ethylene accelerated the decline of fi rmness and promoted the respiration rate and ethylene production of peach fruits during postharvest storage and resulted in earlier appearance of the peaks of respiration and ethylene production. Meanwhile， exogenous ethylene inhibited COX activity and the expression level of COX Ⅲ gene throughout the storage process and suppressed the expression of COX Ⅰ and COX Ⅱ genes in the later stage of the storage period. Exogenous ethylene inhibited the respiration via COX pathway and accelerated the softening and senescence of fruit.

peach； ethylene； mitochondria； respiration rate； cytochrome C oxidase

TS255.1

A

1002-6630（2015）24-0302-05

10.7506/spkx1002-6630-201524056

2015-05-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101586）；江蘇省科技計劃項目（BC2013401）；

江蘇省自然科學基金項目（BK2010310）

闞娟（1980—），女，副教授，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：kanjuan@yzu.edu.cn

金昌海（1963—），男，教授，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：chjin@yzu.edu.cn